todiky a postupy mikrobiální Diverzita mikrobiálních společenstev Společenstva mikroorganismů = složitý systém vazeb mezi sebou i s okolním prostředím Hlavní mechanismy mezi- a vnitrodruhových procesů: • kooperace (u mikroorganismů něj častej i substrátová) • kompetice (antibiotika) • symbiózy s rostlinami (jsou často sledovány jako eko(toxiko)logický endpoint) todiky a postupy mikrobiální Selekce, strategie Hlavní hybatele: • selekce • diverzita • sukcese Strategie a selekce: r a K stratégové - lze je vidět v rovnici růstu: dX 1 ( dt X V — X K J r = rychlost růstu populace na jednotku kapacity prostředí K = únosná kapacita prostředí Během studia mikrobiálních společenstev bylo prokázáno, že mikroorganismy praktikují buď jednu, či druhou stategii. Selekce, strategie r stratégové • vysoká reprodukce • strategie je růst, jinak ne příliš schopni kompetice • většinou zymogenní org: • začínají kolonizaci nových prostředí • strategie maximálního růstu (umax) • lépe přežívají v nízkých hustotách společenstva, v prostředích nelimitovaných substrátem • "growers" K stratégové • konzervativní • využívají "pečlivě" zdrojů' • většinou autochtónni • lépe přežívají v diverzifikovaném společenstvu • závisí na svých specializacích (na daném prostředí) ■ • "non growers" Lze stanovit např.: -jejich podíly na substrátem indukované respiraci (SIR) - lze inhibovat r stratégy v pokusech s minimálním přídavkem substrátu (např. acetát) Biodiverzita -je funkcí ekosystému (ekosystém má mnoho/málo nik ===> biodiverzita je velká/malá) Nerovnováha: ekosystém má mnoho nik a ty nejsou zaplněny (např. ve zničených či stresovaných ekosystémech) Stabilita: stabilní vztahy mezi populacemi, uvnitř populací a mezi organismy a prostředím Stability je většinou dosaženo na konci sukcese (nebo pravdivej i v jejím subfmálním stádiu) Diverzita = rovnoměrnost rozložení jedinců do skupin = informace Větší diverzita = větší "pool" informací (strategií, enzymů, genomů ...) = menší energie nutná na udržení celku = vyšší stability Specifika mikroorganismů: různé druhy a rody mohou zastávat podobné funkce (větší smysl má tedy funkční než taxonomická diverzita) Vysoká diverzita zajišťuje stabilitu ekosystému Pokud je zásah, je tolerance vyšší u diverzifikovaného společenstva v- Často má inverzní vztah s produktivitou 5 «7 M~^ MT •/ ^5 Biodiverzita - tíhne být nízká ve specializovaných ekosystémech, kde je jeden faktor určující (variant) Přirozený stav pro mikrobiální společenstva je vysoká diverzita - snižována je stresem a negativními zásahy. ====> biodiverzita mikroorganismů je ideální mírou biologické kvality systému - Table 6.1 Examples of diversity indices 6 Soecies richness (ď) d S~ where S ~ number of species log N N — number of individuals Shannon-Weaver index of diversity (H) H = — (N log JV - S «i '"g «<) N where C = 2.3 JV = number nť individuals n- = number of individuals in the i&- species Evenness (ť) u e where // - Shannon-Weaver diversity index lojr S S - number of species Equ.itability (J) J - where H - Shannon-Weaver diversity index H = theoretical maximal Shannon-Weaver diversity index lor the population ejtřimined—assumes each species has only one member. taxonomická strukturální ?? interpretace ?? ?? kvantitativní míry ?? ?? vzájemné vztahy markerů ?? 7 A. Genetické a molekulárni techniky 8 Genetické a molekulární techniky - primárně používány pro identifikaci, ale sekundárně využitelné i při hodnocení biodiverzity (proto uvedeny v této části), jako biomarkery apod. Příklady: • próby DNA - identifikace typů bakterií • RT-PCR (reverse transkriptase. - polymerase chain reaction) - určí, které geny jsou funkční na vyizolovaných bakteriích atd. Ale i přímé hodnocení genetické diverzity - vyjádří heterogenitu DNA společenstva: Rychlost reannealingu: extrakce DNA - čištění DNA - měření opětovného spojení řetězců po denaturaci (reannealing) C0.t1/2 •••• iniciální koncentrace DNA x čas, který je potřeba na reannealing poloviny - rychlost je spojena s podobností fragmentů: rychlý reannealing ==> malá diverzita - např. v půdě C0.t1/2 = 4600 odpovídá 4000 různých genomů (cca 200 x vyšší diverzita než byla naměřena u stejné půdy izolačními technikami) 9 Metodiky a postupy mikrobiální ekotoxikologie Environmental sample není nutná ■ŕ/ Extraction kultivace mikroorganismů e'c/ Community r lucleic acids rRNA X oßX PCR \ /rt-pcr _■ jS Dot/Southern blot , Community fingerprints Nucleic aciu proues <^ *■ uommunny iuima *■ (DCClE RFLP) Shotgun clon ng y Cloning / \%„ ^ rDNA clones <&/ .; \ Screening / Sequencing / \ rDNA sequences and databaso ' - Comparative analysis ■. T Pívylogenetic trees Figure 7.7 Phylogenese relationships of microorganisms in environmental samples can be determined without viable culturing based on nucleic acid analyses. In particular, analysis of ri boso mal RNA genes provides the tools for identifying specific microbial populations. Reverse transcription (RT) and amplification of DNA using the polymerase chain reaction (PCR) are useful in obtaining sufficient quantities of target nucleic acid sequences for analyses. Based on specific diagnostic gene sequences, gene probes can be designed to detect specific target organisms, in this manner complex microbial communities can be afiaJyzed. (Note: DGGE = denaturing gradient gel electrophoresis, RFLP = restriction [ fragment length polymorphism.) (Source: Pace 1996.) 10 Genetické a molekulární techniky - základem většiny genetických technik je klonování fragmentu DNA (není nutná kultivace), RNA se používá méně často (její extrakce a stabilita je horší) Kroky obecně: 1) extrakce DNA a) promývání a frakcionace buněk gradientovou centrifugací, následuje lýze a extrakce b) lýze buněk in situ, extrakce, separace DNA od Corg (chromatografie, elektroforéza, srážení, extrakce,, centrifugace) 2) fragmentace <====> hybridizace Fragmentace - využití restrikčních enzymů; Denaturace - chemická či teplotou 3) detekce, např. separace na gelové elektroforéze - agarózová či polyakrylamidová - na základě velikosti fragmentů (kilobáze) dojde k separaci (malé jsou nejrychlejší) - porovnání proužků s markery o známé hmotnosti Verification of PCR product on agarose or scparidc gel lkb: 5*0- 300- —1857 ladder PCR fragments 11 todiky a postupy mikrobiální ekotoxikologie Genetické a molekulární techniky - extrakce DNA z půdy , f t » " Soit «•*** sediments Bacterial cell extraction Blend/vortex in buffer to release cells Centrifuge at 1,000 x g Collect supernatants Centrifuge to collect cells at 10,000 x g Lyse cells with iysozyme Centrifuge at 1,000 x g • Cellular debris ln-situ direct lysis Physical disruption via freeze/thaw or sonication of soil and buffer Chemical lysis via SDS and Iysozyme Centrifuge at 10,000 x g Soil and cellular debris Supernatant containing DNA Purification via commercial gel columns Phenol/chloroform extraction Ethanol precipitation to produce pure DNA 12 todiky a postupy mikrobiální Genetické a molekulární techniky - extrakce DNA z půdy TABLE 8.3 Comparison of Bacterial Fractionation and In Situ Lysis Methodologies for the Recovery of DNA from Soil Issue Vield of DNA Representative of community Source of DNA recovered Degree of DNA shearing Average size of DNA fragments Degree of humic contamination Ease of methodology Bacterial fractionation 1-5 ^g/g Less representative because of cell sorption Only bacteria Less shearing 50 kb Less contaminated Slow, laborious In situ lysis 1-20 /xg/g More representative, unaffected by cell sorption Mostly bacteria More shearing 25 kb More contaminated Faster, less labor intensive 13 todiky a postupy mikrobiální ekotoxikologie Genové próby - slouží k detekci specifické NA sekvence a ke kvantifikaci jejího množství - DNA je po extrakci, izolaci a purifikaci fixována na membráně, denaturovaná a hybridizována s DNA próbami - próby jsou značeny radioaktivně (32P), digoxigeninem (DIG), biótinem či fluoresceinem Step 1 Target DNA is isolated #%á% dsDNA Step 2.Target DNA is denatured to ssDNA using heat or alkali Step 3Target DNA is fixed to nitrocellulose paper Step 4. Hybridization of probe to target DNA Step 5. U n hybridized probe is washed off and chromogenic substrate or photographic film is used to detect the remaining probe Negative ^i^^TV }- • \ = Positive ssDNA ssDNA Radioactive or chromogenic label -DNA probe Positive results are determined by color change or darkening of the photographic emulsion 14 todiky a postupy mikrobiální Genové próby - pokračování - detekce přímá pomocí autoradiografie (fotografický obraz) nebo nepřímá navázáním protilátky či straptavidin-fosfátového konjugátu a následné detekce fluorescence, chemiluminiscence či kolorimetricky Types of labeled DNA probes Ô DIG Biotin ■ Fluorescein I Binding of antibody conjugate to DIG Colorimetric substrate 1 Purple - blue color + Visual detection 1 Binding of streptavidin to biotin Chemiluminescent substrate 1 Luminescence + Pi I X-ray film detection 1 Binding of antibody conjugate to fluorescein Fluorescent substrate i Fluorescence + Pi Fluorometer detection Alkaline phosphatase «*^ Target DNA Antibody Streptavidin if FIGURE 13.2 Gene probe detection of a DNA sequence. 15 Genové próby - aplikace Colony hybridization - aplikace pro celé kultury na agarových plotnách Princip! filtrační papír je otisknut na Petriho misce, , takže dojde k adhezi buněk z kolonií; následuje lýze buněk; označení radioaktivními próbami a detekovány Colony Hybridization **■ # VIKING CONTROL KIM 5 -CONTROL 4k Ěk til NOOULE ISOLATES FIGURE 13.4 A colony lift from a petri plate containing a mixed population of the nitro gen-fixing bacteria rhizobia isolated from root nodules. The gene probe was constructed from a unique plas-mid associated with the isolate known as KIM 5. (Reprinted from Soil Biol Chem., 21,1. L. Pepper et. al.f "Strain identification of highly competitive bean rhizobia isolated from root nodules: use of fluorescent antibodies, plasmid profiles and gene probes, " pp. 749-753, © 1989 with permission from Elsevier Science.) 16 todiky a postupy mikrobiální ekotoxikologie Genové próby - aplikace Southern and northern blotting - southern blotting identifikuje DNA, northern RNA Princip! NA jsou separovány gelovou elektroforézou a následně přemístěny (= blotting) na membránu, kde jsou hybridizovány s próbami FIGURE 13.5 Southern blot of a DNA sequence associated with a unique plasmid contained within the rhizobial strain KIM 5. The upper portion of the figure shows the original plasmid profiles of two different rhizobial isolates. The gene probe was constructed from the smallest plasmid associated with this strain. Isolates that do not contain the small plasmid are not detected. The bottom portion of this figure shows the Southern blot. (Reprinted from Soil Biol. Cheni, 21, I. L. Pepper et. al, "Strain identification of highly competitive bean rhizobia isolated from root nodules: use of fluorescent antibodies, plasmid profiles and gene probes, " pp. 749-753, © 1989 with permission from Elsevier Science.) 17 Genové próby - aplikace Dot blotting - technika hodnotící přítomnost dané sekvence NA bez přecházející separace na gelu Princip! identická množství NA jsou přeneseny na nitrocelulózový filtrační papír a následně próbovány FIGURE 13.6 Dot blot hybridization showing detection of two bacterial isolates. Arthrobacter isolates that degraded toluene, ethyl-benzene, and xylene (TEX) and Sphingomonas isolates that degraded xylene (X) were detected by the use of two individual gene probes. (Photos courtesy E. M. Jutras.) 18 todiky a postupy mikrobiální Genové próby - aplikace In situ hybridization - užívá próby, které přímo hybridizují s cílem uvnitř buněk, nejčastěji hybridizace na 16S rRNA, což je výhoda neboť rRNA je v buňkách mnoho (104) -> silný signál - síla signálu je úměrná počtu ribozómů a tím pádem idikuje růstovou rychlost mikroorganismů - signál detekován epifluorescenčním mikroskopem Table 13-2 DNA Probes Probe Sequence Reference Archaebaclcrial probe TCCOGCRGGATCAACCGGAA 17 Eu katy otic pru be GGGCATCACAGACCTG 17 E üb acte Hal probe A CCGC ľ ] Ti T-G CGGGC: CC 17 Universal probe GWATTACCGCGG CKGCTG 17 Cünlrtil probe GJ G CCAGC M G CCGCGG 17 ALFlb, alpha 1 ós proteo baettria" CGTTCG(C/T)TCTGAGCCAG 27 BET42af beta 23 S proteo bacteria GCCľTTCCCACTTCGTlT 27 GAM42a, gamma 23S proteobacteria G ccTTCcc a c: atctí rrr 27 EUB338, eubiteteria I6S GCTGCCTCCCG1AGGAGT 2, 52 Ľucaryo.ÍĽ ACCAGACTTGCCCTCC 2 R = puiiirc; W = A oj T; K = G or T; M = A or C. jAIm> delecfs somi; non-;j j p ha group bíät'leria. 19 Metodiky a postupy mikrobiální ekotoxikologie PCR - polymerase chain reaction - dojde k ' naamplifikování určitého fragmentu NA . - dnes již v podobě křtů - minimální vybavení (termocycler) užití pro detekci specifických mikrobiálních skupin Princip: máme 2 primery, DNA polymerázu, směs nukleosidfosfátů; cykly inkubačních podmínek v termocycleru (disociace, annealing, extenze); detekce na gelové elektroforeze po barvení ethidium bromidem Step 1. DNA containing the target sequence is released from sample to provide the template for the PCR. Step 3. Microcentrifuge tube is placed in a thermocycler and subjected to 25 - 50 cycles of denaturation, annealing and elongation temperatures. Step 2. Template is combined with a PCR mixture in a microcentrifuge tube. A. PCR buffer B. Mg2 C. Nucleotides (ATP, GTP, CTP, TTP) D. Thermostable polymerase E. Forward and reverse oligonucleotide primers specific for the target sequence 1DDoC| Denature o°c Extend Anneal Step 4. Amplified product is analyzed by molecular weight separation on an agarose gel using electrophoresis and detected by staining with ethidium bromide. 0 1 2 3 4 Time (minutes) Lane 1 100bp DNA ladder 2. Negative control 3-6.Target PCR products 20 todiky a postupy mikrobiální ekotoxikologie PCR - polymerase chain reaction wanted gene template DNA PCR ; Polymerase Chain Reaction m cycle nTrmnrTTWTTmnmTn r —i 30 - 40 cycles of 3 steps : Step 1 : d ena tu ration 1 minut 94 ŮC 'ÍTIT^ITÍM^ -^%^ 3' Step 2 : annealing s 45 seconds 54 °C forward and reverse ľ primers!!! y Step 3 : extension IFíÄiC!11 -.i X \ 2 minutes 72 °C only dNTP's (Andy Viŕrylrwií IHM1 2nrl cycle :<^ihe> cycle 4lh cycle < = Exponential amplification < < < ■■<■ ■■<■ ■ SLB - signature lipid biomarkers -jsou velmi diverzifikované: několik skupin a v rámci nich jsou lipidy s mnoha strukturními variacemi - každý mikroorganismus má charakteristický "pattern" složení lipidů, který může být užit jako diagnostický parametr Příklady: ^^r C27,C28,C29 M luteus rod Micrococcus dle větvených nenasycených FA: <^^ ► ^zs^žefiii M. varians ^^* C30,C31,C32 M sedentarius 29 Analýzy lipidů: PLFA -. phospholipide fatty acids - lipidy buněčných membrán jsou tak specifické, že mají povahu až biomarkerů ===> SLB - signature lipid biomarkers -jsou velmi diverzifikované: několik skupin a v rámci nich jsou lipidy s mnoha strukturními variacemi: 1) Jednu velkou skupinu tvoří mastné kyseliny vázané v původní makromolekule fosfolipidu esterovou vazbou (EL-PLF A): a) nasycených PLFA (SATFA - saturated fatty acids) b) mono-nenasycených (MUFA - mono-unsaturated fatty acids) c) vícenásobně nenasycených (PUFA - poly-unsaturated fatty acids) d) hydroxy-substituovaných (PLOH) 2) Druhou velkou skupinu tvoří mastné kyseliny vázané v původní makromolekule přes neesterovou vazbu (NEL-PLFA): a) UNSFA - nasycené i nenasycené mastné kyseliny ahydroxy-substituované (UNSOH). . Konkrétní sloučeniny mastných kyselin jsou stanovovány stejné v obou frakcích, tedy EL-PLFA i NEL-PLFA. Liší se tedy pouze způsobem navázání v molekule fosfolipidu. UNSFA tedy zahrnují stejné molekuly jako SATFA+MUFA+PUFA, pouze místo karboxylového konce, mají jiné zakončení pocházející z hydrolýzy neesterové vazby. Analogicky totéž platí pro PLOH a UNSOH. 30 todiky a postupy mikrobiální Analýzy lipidů - názvosloví - základní část vlastního názvosloví tvoří poměr X:Y, kde X je počet uhlíků v řetězci kyseliny a Y značí stupeň nenasycenosti, tedy počet dvojných vazeb v makromolekule - pozice dvojných vazeb je pak číslo v závorce s tím, že pokud je u něj c, respektive t, znamená to cis, respektive trans konfiguraci - písmeno n znamená normální nevětvený řetězec - zkratka br znamená rozvětvenou molekulu o methylovou skupinu - písmena i a a pak znamenají iso a anteiso pozici methylové skupiny - písmeno p čip následováno číslem znamená pozici methylové skupiny od karboxylového konce molekuly - cyklopropylové skupiny na PLFA mají v názvosloví zkratku cy - - pozice hydroxy skupiny v řetězci je vyznačena jako a, ß od karboxylového konce, či od alifatického konce řetězce symbolem co následovaným číslem, například co-\ - písmeno d znamená dikarboxylové mastné kyseliny 31 todiky a postupy mikrobiální Analýzy lipidů - analýza - složitá separace a extrakce; esterifikace na FAME - analytická koncovka je GC-MS: na základě MS je identifikována mastná kyselina a na základě retenčního času pak již může být rutinně analyzována - existují knihovny FA pro MS abundance 34000 30000 28000 - 26000 24000 22000 2GO0O - 18000 16000 14000 12000 6000 4000 Tifz-> 50 MS spektrum methyl esteru trikosanové kyseliny il I. .i|U'1'.'-l| 185 I. . 213 227 241 255 269 _L_ 325 297 311 I 337 SOIL SAMPLE Q one-phase extraction 9 undisturbed lipids soil residue \ neutral lipids glycolipids phospholipids \ a mild alkaline methanolysis 0 SPE-NH, - column hydroxy substituted SPE-SCX - column i í r unsaponifiables __i ( acidic hydrolysis j \ SPE-SCX - column 1-------- T SATFA MUFA PUFA PLOH USFA UNSOH 32 Analýzy lipidů - PLFA jako biomarkery - informují o složení mikrobiálního společenstva: větvené PLFA typicky bakteriálního původu. PUFA, zejména 18:2 charakteristické pro Eukaryota1 suma relativní abundance iso a anteiso izomerů 15:0 větvených PLFA . reprezentují bakterie poměr mezi iso(anteiso) 15:0 větvenými PLFA a 16:0 větvenými PLFA ■ ■« ■' i = relativní zastoupení bakterií i i 18:2 w FA ■ i = houby - poskytují ale i další informace: poměr cis a trans izomerů MUFA pokud vyšší než 1 může značit strádání či env. stres poměr nasycených / nenasycených indikace stresu poměr cykropropyl FA/jejich monoenoic prekursory poměr iso 15:0 / anteiso 15:0 a iso 17:0 / anteiso 17:0 todiky a postupy mikrobiální Analýzy lipidů - PLFA jako biomarkery Table 2 Marker fatty acids (FAs) of selected microbial groups inhabiting soil ecosystem Microbial group Gram-negative bacteria Gram-positive bacteria Actinomycetales Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides Pseudomonas Arthrobacter Fungi Eukaryotic algae and Protozoa Fatty acids (FAs) OH FAs (usually 3 OH) monoun saturated FAs (e.g. 16;lw7t, 16:lw5c, 18:lw7) cyl7:0, cyl9:0 Iso- and anteiso FAs (e.g. i 15:0, A15:0, il6:0, il7:0, al7:0) 10 Me FAs (e.g. 10 Me 16:0, 10 Mel7:0, 10 Mel8:0) 16:lw5c FAs with odd number of C 16:0 and 16:lw7c (equiv. proportions), 18: Iw7c/w9t/wl2t FAs with even number of C al5:0 and al7:0 (high proportions) 16:lw5c (in arbuscular fungi) 1 8:2w6,9c 18:lw9c, 20:4 23:0, 25:0, 21:0 Polyunsaturated FAs (e.g. 16:lw4, 16:3, 18:4w3, 20:4, 20:5, 22:6) Source Cavigelli et al. (19951 Zelles (1999a), Zelles (1999b) Pennanen et al. (1998), Zelles (1999a,b) Frostegärd et al. (1993), Kelly et al. (1999) Frostegärd et al. (1993), Kelly et al. (1999) OŘsscm and Persson (1999) Haaciet al. (1994) Olsson and Persson (1999) Haack et al. (1994) Olsson (1999) Frostegärd et al. (1993.1996) Lindahl et al. (1997) Zelles (1999b) Findlay (1996), Frostegärd et *. i 199^) 34 Metodiky a postupy mikrobiální ekotoxi 11 • Analýzy lipidů - PLFA jako biomarkery ■ , , Table 1. Common phos pholipid biomarkers and their interpretations Indicator Interpretation Origin of Sample Source Comments \ Polyunsaturates *r Microeukaryotes Isolates [23, 32] Do not occur in bacteria 18:2w6c (llr.lbf) * Fungi Isolates [39] 10Mel8:0 ^ Actinomycetes Isolates [21] 18:3, 20:3, 20:4, 16:1ü)5c ^•Mycorrhizae Isolates [27] Branched (i, a, Me) -^-Gram-positive bacteria Isolates [17] Also in Gram-negative bacteria Cyclopropyl 17 & 19 Aerobic bacteria Anaerobic bacteria Starvation Sediment in microcosm Soil in microcosm Isolate [30] [13] [14] Cyclo/precursor ratio y~ Stress indicator Isolate Isolates Isolate [20] [22] [36] High in acidic conditions, low 02, and high temp High in late logarithmic and stationary growth phase High in starved conditions trans/cis ratio ^4 Stress indicator Isolates Isolates [14] [19] High with starvation Ratio increased with desiccation in Gram-negative, but not Gram-positive bacteria 18:1w8c y~ Type II methanotrophs Isolates Soil [5, 24, 25] [26,31] Enriched in soil exposed to methane Monounsaturated 16 % Type I methanotrophs Isolates [5, 24] Not specific to Type I carbon fatty acids methanotrophs; very low occurrence in soil exposed to methane [25] 10Mel6:0 Desulfobacter Isolates [7] When not with 10Mel8:0 il7:lw7 Desulfovibrio 3 strains [8] Desulfovibrio Isolate [32] Not found in sediments with desulfuňcans known sulfate reduction (31) 17:10)6 DesulfobuWus 3 strains [29, 33] 35 todiky a postupy mikrobiální ^L^'VWVÍ!^ [j** Table 2. Ratios and sums or PLFA used in data analysis Name Definition Fungal/bacterial biomass (fung/bact) Cyclopropyl 17/precursor (cyl7/pre) Cyclopropyl 19/precursor (cyl9/pre) Total monounsaturated/total saturated (mono/sat) Total hydroxy 18:2w6c/il5:0 + al5:0 + 15:0 + il6:0 + 16:1ü>5c + il7:0 + al7:0 + 17:0cy + 17:0 + 18:lo>7c + 19:0cy 17:0cy/16:l(i>7c 19:0cy/18:lo>7c 14:lü>5c + 15:1ü)6c + 16:lo>7c + 16:1ü)5c + 17:lw9c + 18:l(o9c + 18:«)7c/12:0 + 13:0 + 14:0 + 15:0 + 16:0 + 17:0 + 18:0 + 20:0 15:0 30H + 16:1 20H + 16:0 20H + 18:0 20H 36 Metodiky a postupy mikrobiální Příklad: Table 1. Metal impact on selected phospholipid fatty acids (PLFAs) in forest humus in Scandinavia. The ratio between the relative abundance in metal rich soil to that of noncontaminated soil is given. Metal PLFA i16:0 br17 brIB 20:4 Cd, Cu, Ni, Pb. or Zna3 Mainiy Cub) Cd, Cu, Pb, and Zn a.o.c) Pbd) 0-8-2.3 1.7 1.7 1.4 1.5-4.4 2.9 2.2 7,9 mm» 3.5 2.3 15.3 llil a) Laboratory study (20) b) Field data, Harjavalta smelter. Finland (22) c) Field data, Rönnskär smelter, Sweden (22) d) Field data, naturally Pb-rich soil, Norway (Bááth, Díaz-Raviňa, Bakken, unpubl. data) ■*M*HWW4.. Ö.Ö2-G.06 Ö.Q7. 0.38 37 Další indikátorové látky - biomarkery ergosterol - houby (HPLC) muramová a diaminopimelová kyselina - prokaryota (HPLC) lipopolysacharidový lipid A mastné kyseliny a kyselina teichoová - G- a G+ (GC/MS) hydroxy FA, plasmalogeny a sfíngolipidy - anaerobní populace bakterií todiky a postupy mikrobiální C. Funkční diverzita systém BIOLOG 39 Funkční diverzita - systém BIOLOG - systém BIOLOG využívá jednoduchých uhlíkatých substrátů, které se většinou vyskytují přirozeně v půdním prostředí; tyto jsou v 96-jamkových mikrodestičkách spolu s barvivem a na základě schopnosti, či neschopnosti mikroorganismů využívat jednotlivé substráty vzniká specifický "fingerprint", který buď identifikuje mikroorganismus (identifikační přístup), nebo fyziologický potenciál společenstva (funkční diverzita - ekologický přístup) - v prvním případě je použita monokultura, která je po izolaci identifikována pomocí mikrodestiček s 96 uhlíkatými substráty (barvivo je TTC —> TPF; }i=590 nm) - GN2 Microplate™ a GP2 Microplate™ -rutinní využití k identifikacím mikroorganimů v celé řadě oborů - druhý způsob využití, méně častý a poměrně nový, je přístup hodnocení diverzity mikroorganismů technikou fyziologické profilace na úrovni společenstva (CLPP - community level physiological profiles); pro tento účel byly vyvinuty BIOLOG EcoPlates™ - mikrodestičky, které obsahují 3 krát 31 vybraných uhlíkatých substrátů a jejichž schopnost profilovat metabolický "fingerprint" společenstva je využitelnější zejména pro statistické hodnocení (méně "proměnných") Systém BIOLOG pro identifikaci mikroorganismů - systémem BIOLOG je možné rychle a laboratorně nenáročně získat širokosubstrátový "fingerprint" izolovaných kultur, který umožňuje s pomocí v současné době nejrozsáhlejších databází (zahrnují vice než 1900 mikroorganismů) jejich identifikaci - identifikaci obstarává několik typů software od firmy BIOLOG, které na základě metabolického "otisku" bakterie identifikují o který druh se jedná - systémy se liší cenou a vybavením - nejjednodušší verzí je MicroLog 1™, který obsahuje pouze prohledavač databází "fingerprintů", které se objednávají zvlášť dle potřeby (GP, GN bakterie, kvasinky apod.) Srovnání: databáze BIOLOG pro gram negativní bakterie obsahuje 501 aerobních druhů x • Bio Mérieux API 20E® & NFT obsahuje asi 180 aerobních druhů • Bio Mérieux API 20E® GNI+ obsahuje 104 aerobních druhů databáze BIOLOG pro gram pozitivní bakterie obsahuje 318 aerobních druhů x • Bio Mérieux Vitek® GPI obsahuje 49 aerobních druhů • Bio Mérieux API® Staph, 20 Strep, & coryne asi 106 aerobních druhů 41 todiky a postupy mikrobiální Systém BIOLOG pro identifikaci mikroorganismů Postup: Ml 11 = 11 Mil 111 = 1 lili 1111=1111 I ■ I I■ = I I ■I lili 1 = 111 li -BireDjcrr -BJPSĎJER -BS? -B6FSDJ=lJITTn:C - B ! FSDfUT TiPÍ JC -BSFSDfUTTIPEE-l -BÍFSDfIITTWE*! -C lůPSCHEH -C11KO.aE -C iJ-PSC-.Pii I I MhII I I I I I I ■■■ I I I I I II ■■ I I i 11111! li 11 I li i lil 11 11 rl 1. KROK: Izolace čisté monokultury na mediu od firmy BIOLOG a různé barvení a testy pro identifikaci testovacího protokolu (čas a teplote inkubace destičky). 2. KROK: Příprava inokula o požadované hustotě. 3. KROK: Inokulace mikrodestičky a kultivace při danných teplotních podmínkách. 4. KROK: Identifikace "fingerprintu" na mikrodestičce pomocí softwaru £ datbází BIOLOG. 42 todiky a postupy mikrobiální Systém BIOLOG pro identifikaci mikroorganismů GP2 MicroPlate™ AI fit L-AniblnoM C1 Mann Mam In* Bit a-D-GtacoM E9 Butyric Ackl Propionic AeW 07 OlyeytL- Qlutamlc AcW HB AdafM>airt*-S-Macioph capita t* H7 Tbymtdtat^-C"-' Monůphwplwta GS L-Pyrogrubrmte Acid C10 ß-Malhyl D-Galactoalda Oto Ď-SofWtol Cti 3-MaIftyl G tu cot« Ata Amygdaiai B12 nHnaattol »Malhyl D-Glucoald« D11 StvchyoH E10 p-Hydroxy PtwiylAcitle Acld Pyruvic Acld F10 Suctiflimlc AcM 09 L-Sartn* HS Ufldlna-*'-MonoplmphMt m FniCtOM-6- Ptwphat* Ell n-Kato GlutSTk Acld DII Sucroaa E12 teKalo Valnic Acld F11 Succinic AcM H-Auty* L-Gtutamk! Acld G1D futra« lni HID Glucoaa-l- PhotptMi* 011 2,3-Butanadtol H11 Gliicoaa-S- Phoaphit* Ol 2 Glycerol HI2 D-L-a-GhWMQl Phoaphat* 43 Systém BIOLOG - funkční diverzita mikrobiálních společenstev - BIOLOG mikrodestička EcoPlate™ byla vyvinuta speciálně pro účel studia funkční diverzity mikroorganismů a ekologie mikroorganismů - zaznamenává "fingerprint" metabolického potenciálu společenstva, založený na principu utilizace vybraných zdrojů uhlíku metabolický potenciál společenstva = funkční diverzita = blízky vztah k ekologické významům - studie byly publikovány ve všech oblastech enviroměntalistiky, asi nejvíce je ovšem studium mikrobiální biodiverzity rozvinuto u půdních mikrobiálních společenstev - BIOLOG systém byl úspěšně využit pro posouzení vlivu zemědělského managementu, degradace, chemikálií, vlivu pH, vlivu zaplavování půdy pro půdní mikrobiální společenstva todiky a postupy mikrobiální Systém BIOLOG - funkční diverzita mikrobiálních společenstev EcoPlate™ AI Watar A2 ß-Mathyt-D- Glucoalda B1 Pyruvic Acid Mathyt Eatar B2 D-XyloM _ L-Arginlna A1 Water B4 L-Aaparaglna C1 Twa«n40 ca l-Erythritol ? A2 ß4lathyl-D-GlucoaMa D-Galactonic |acW y-Lactona A4 L-Arglnina Pyruvic Acid Mathyl Eatar B2 D-Xyloaa TAT Iwi Watar l3~ B4 0. [L-Aaparaglna Qalacturonlc Acld IA2 ß-Mathyl-D-Glucoaida \C3----- W* 2-Hydroxy |L-BanzolcAcId Phanylalanlna C1 Twaan 40 C2 l-Erythrttol C3 ] 2-Hydroxy Banzolc Acid BI Pyruvic Acid Methyl Eatar D1 Twaan 80 D2 D-Mannltol . TÖ3 4-Hydroxy I Banzolc Acid D4 L-Sarina D1 Twaan 80 D2 D-Mannltol C4 L-Phanylalanlna 03 4-Hydroxy Banzolc Acid A3 D-Qalactonlc Acid y-Laetona L-Arglnina B2 D-Xyloaa C1 Twaan 40 B3 D- Galacturonlc Acid B4 L-Aaparaglna C2 |-Erythritol 04 L-Sarlna E1 a- Cyclodaxtrln ______ E2 N-Acatyl-D- ., Qlucoaamlne I Hydroxy butyric Acid E4 L-Thraonlno F1 Olycogan F2 D-Qlucoaamlnlc Acid te--------- |D-Callobloai F3 Kaconlc Acid El a* Cyclodaxtrln F4 Olycyl-L-Glutamic Acid G2 Glucoaa-1* Phoaphata E2 N-Acatyt-D- Glucoaamlna E3 Twaan 80 ^3~ |C4 2-Hydroxy |L-BanzolcAcId [phanylalanlna D2 D-Mannltol 4-Hydroxy lL-8arlna I Banzolc Acid Hydroxybutyrlc Acid IE1 [Ě4 L-Thraonlna o- Cyclodaxtrin 03 a-Katobutyrlc Acid HI a-D-Lactoaa H2 D,L-o-Qlycarol Phoaphata G4 Phanytathyl-amina F2 D- Gtucoaaminlc Acid Gl D-Caltobloaa F3 Kaconlc Acid 1F4 Glycyl-L-Glutamtc Acid TÍ3 E2 N-Acatyl-D- y I Glucoaamlna Hydroxybutyrta 'Acid E4 L-Thraonlna H3 D-Mallc Acid IH4 Putraacina G2 Glucoaa-1* Phoaphata G3 a-Katobutyrlc Acid F1 Glycogan F2 D-Glucoaaminic Acid F3 Kaconlc Acid [HI a-D-Lactoaa 1H2 D,L-o-Glycarot Phoaphata G4 Ptwnylathyl-amlrta H3 G1 D-Callobioaa G2 Glucoaa-1 -Phoaphata F4 Qlycyl-L-GluUmlc Acid G3 a-Katobutyrlc Acid G4 Phanytathyl- amlna H4 D-Mallc Acid Iputraaclna H1 a-D-Lactoaa __I FIGURE 1. Carbon Sources in EcoPlate H2 ID.L-o-Qlycarol Phoaphata H3 D-Mallc Acid 45 Metodiky a postupy mikrobiální eko 1 • -m -m • Systém BIOLOG - funkční diverzita mikrobiálních společenstev - ECO Plates > Table 1 " t Carbon substrates in Biolog ECO microplates. Assignment tc biochemical categories follows that of Insam (1997) Polymers Carboxylic acids a-cyclodextrin -y-hydroxybutyric acid glycogen ot-ketobutyric acid Tween 40 i D-galacturonic acid Tween 80 D-glucosaminic acid ■ itaconic acid Carbohydrates D-malic acid8 D-cellobiosea 1 pvruvatic acid methvl ester i-erythritol 1. D-galactonic acid 7-lactone Amino acids N-acetyl-D-glucosamine L-arginined glucose-1 -phosphate L-asparagine >■ ß-methyl-D-glucoside glycyl-L-glutamic acid D,L-ct-glycerol phosphate L-phenylalanine a-D-lactose L-serine D-mannitol L-threonine D-xylosea Amines phenyl ethylamine putrescine Phenolic compounds 2-hydroxybenzoic acida 4-hydroxybenzoic acida a Indicates substrates not present in GN plates. 46 Systém BIOLOG - hodnocení Hodnocení: Sledování AWCD (average well colour development) či integrace plochy pod křivkami (CI) Získané parametry: 1) AWCD pro celou destičku či AWCI pro celou destičku 2) (C-R), kde C produkce barvy (např. po 120 h) v jamce substrátu, R produkce barvy v jamce AI 3) (C-R)/AWCD - standardizováno (např. pro PC A) 4) CI pro každý substrát 5) CI/AWCI todiky a postupy mikrobiální Systém BIOLOG - hodnocení AWCD (average well color development) GN plates ECO plates 2.0 1.5 1.0 0.5 - 20 40 60 Hours r---------r 80 100 120 140 0.0 ^™ 20 40 60 80 100 120 140 Hours Fig.^1. Variation in average well color development (AWCD) over time in Biolog's GN and ECO plates (BW=Ballast water, CB = Chesapeake Bay, TC = Tidal creek, OP = Oceanography Pond, TP = Tony's Pond, GW= Groundwater; open symbols indicate freshwater environments, filled symbols indicate saltwater environments). For GW, one of the four replicate ECO plates was lost in processing; therefore, in this and subsequent figures, ECO plate data were generated by only three replicates. 48 Systém BIOLOG - hodnocení Při vyhodnocení se často vytváří tzv. CLPP - community level physiological profile: - každá jamka mikrodestičky představuje potencionální mikrobiální funkci s výstupem ano/ne (reagovalo/nereagovalo) - tento výstup však nemá pravděpodobnostní charakter a pro jakékoliv statistické metody představuje problém - proto se při několikaterém zopakování vytváří hodnota ekologické abundance (pro každou jamku) - tedy např. pozitivní reakce 9 krát z 10 = 90% - vznikají pseudo spojitá čísla, se kterými se pak vstupuje do vícerozměrných analýz o c co "O CÖ CD > (1) o Biolog substrate Example of a community-level physiological profile (CLPP) obtained from Biolog multiwell plate incubations (31 substrates; 1 blank) with a terrestrial microbial community. The bars indicate relative abundancy (RA) values for different Biolog substrate conversions. The log RA values range typically from -2 to +2 (4 orders of magnitude difference in abundancy value). Inoculum standardisation was applied according to a not yet published method. 49 todiky a postupy mikrobiální Systém BIOLOG - ekotoxikologický systém BIOLOG mikrodestička představuje ideální zminimalizovaný systém, kde můžeme paralelně sledovat průběh 31 až 95 biochemických reakcí: • jednoduchý kolorimetrický výstup • možnpst vynesení křivek dávka odpověď Příklad: 12- 1.0- 0Ĺ O _i 8 °,B- III s O 2 tli > 0.4- < Kontaminace zinkem narůstá ---------------1---------------- 35 HOURS Fig, 1, Comparison of late of colw development on BIOLOG plates far sou samples collected in tne FalS of 1995 from four sites in the vicinity of a Zti smetter. Average well color is the meam of the net optical density for all 95 snhstr»te wells on a ptate. Each data point represents Hie meam AWCD value for three BIOLOG extractions from each site (Sate A ■, Site B •, Site C O, Site D O), 50 todiky a postupy mikrobiální Systém BIOLOG - využití pro hodnocení PICT (Pollution induced community tolerance) -je založeno na přirozené schopnosti mikroorganismů tolerovat do určité míry kontaminanty v prostředí ■ i - ■ i - ■ i - ■ . - ■ . - ■' - při působení kontaminantu na mikroorganismy se projevuje jejich mechanická, genetická a fyziologická adaptace na nové podmínky a dochází k odumření citlivějších společenstev Vlastnímu měření musí předcházet chemická analýza, která má za úkol zjistit, v jaké koncentraci a o jaký kontaminant se jedná. Poté se udělá extrakt z půdy a mikroorganismy se očkují do několika mikrodestiček s rostoucí koncentrací kontaminantu v jednotlivých destičkách. Hodnotí se vývoj barvy. Hodnota EC50 se odvozuje z typické reakce 85 - 90 různých pozitivních mikrobiálních reakcí v ' mikrodestičce, tedy koncentrace kontaminantu versus aktivita mikroorganismů. Hodnotí se posun křivek v jednotlivých ředěních a jejich rozložení. PICT tedy. ukazuje míru toxického poškození společenstva v ekosystému. Před vlastním měřením musí být tedy prokázán toxický efekt kontaminantu na strukturu a funkci ekosystému. reference sampling organ&ms dose effect studies pcŕluted 7 »#•••• concentration field contaminant concentration varsuE sensitivity (»jg. EC2G) i u c o ■c o. "*V 7 I concentration tí sito pollution -community toleraraa NOECpfftjK,* Fizure 1 Schematic representation of the experiment for determination of pollution-induced community tolerance (PICT) (redrawn from Posthuma 1997). 51 todiky a postupy mikrobiální Systém BIOLOG - hodnocení PICT (Pollution induced community tolerance) Příklad: , > 3 * 0.8 3 u ■a i 0.6 c íl) « "o o c OJ CT (U 0.4 - 0.2 0 ± i • 20 km (16 mg/kg)! j ♦ 14 km (35 mg/kg) ! a 6 km (83 mg/T,X,+) with various levels of exposure. The distance to the zinc smelter (in km) and the contamination level are given (bergen brackets: total zinc concentration in mg zinc per kg DW sod). 52 todiky a postupy mikrobiální Diskutovaným tématem je způsob hodnocení diverzity mikroorganismů. Klasické indexy abundance, rozložení a diverzity nejsou vhodné. Biodiverzita mikrobiálních společenstev: v 99% případů je vyhodnocení pomocí vícerozměrných statistických metod Zjednodušený princip -1: - máme 1,2,3 .... n objektů (vzorků vody, lokalit půd, mikrobiálních kultur, variant laboratorního experimentu apod.) a označujeme je x - máme 1,2,3 .... y parametrů (proměnných, např. koncentrací jednotlivých mastných kyselin, četnost pozitivních reakcí na substrát v ECO mikrodestičce apod.) a označujeme je p - maticová podoba vícerozměrných dat: parametry objekty Vzorek č. Cbio BR PR EX-C qC02 As Cd Cr pH(H20) Ntot Corg Jíl Benzo(a)pyren Suma PAHs Suma PCB Suma DDT HCB 229 928,5 2,5 19,2 86,5 2,7 9,1 0,2 28,9 6,3 0,2 2,3 19,9 35,4 419,2 5,187 5,402 0,544 230 844,9 3,6 9,2 258,7 4,2 10,8 0,5 13,5 4,5 0,3 5,0 18,2 13,5 229,3 8,398 8,041 0,823 • 231 ,. 1452,2 2,8 22,7 68,4 2,0 19,4 0,4 37,2 6,3 0,3 3,6 26,7 199,3 • 2734,4 6,462 5,216 0,87 232 340,9 1,0 7,6 74,0 3,0 16,4 1,9 29,1 7,3 0,2 1,8 12,7 75,8 853,9 7,841 57,887 10,797 233 365,5 0,7 5,6 61,2 1,8 18,0 0,4 31,2 7,8 0,2 1,7 33,5 32,9 513 5,202 216,801 11,696 234 436,8 1,4 7,0 105,7 3,1 11,2 2,0 26,9 7,9 . 0,1 1,5 13,5 33,3 471,4 6,867 25,975 5,924 235 385,1 0,7 5,2 81,3 1,9 11,8 1,3 24,0 8,1 0,2 1,6 21,8 62,4 839,4 5,843 131,471 10295,12 236 388,0 1,3 5,6 62,7 ■ ■ 3,4 9,7 0,3 94,0 7,3 0,1 1,5 31,8 6,6 139,4 ■• 4,543 3,951 9,582 ■• 237 1285,0 2,6 15,6 104,8 2,0 9,1 0,5 70,8 7,0 • 0,3 3,1 15,6 27,6 ■ 546 4,362 2,188 ■ 2,542 238 787,5 3,6 12,5 195,4 4,6 18,6 0,7 92,7 7,2 0,3 3,8 20,4 37,7 566,3 7,752 6,339 1,883 239 964,0 1,9 17,8 110,7 2,0 10,5 0,8 58,4 7,7 0,3 3,6 10,0 704,2 6778,4 29,21 24,531 6,282 240 671,6 1,9 6,3 202,7 2,9 15,3 1,1 61,7 7,9 0,2 5,7 6,9 41,1 704,4 8,731 . 14,696 3,402 241 621,4 2,0 6,0 113,8 3,3 12,3 0,5 40,6 7,8 0,2 1,6 15,3 13,4 234,7 5,529 3,559 • , 4,619 242 529,6 1,1 7,2 85,0 2,2 11,5 0,8 27,7 7,9 0,2 1,9 12,6 56,8 | 694,6 8,846 13,133 "1,017 243 1048,4 4,3 20,4 181,4 4,1 11,0 0,5 10,1 6,0 0,3 4,7 5,7 21,6 400,2 9,69 13,289 1,793 244 1052,3 2,3 14,8 114,4. 2,2 8,0 0,4 15,9 6,4 0,3 4,1 11,5 17,9 371,2 . 5,484 ■ 2,538 ' 0,593 . 245 . 527,0 2,0 9,1 127,6 3,8 7,4 0,4 10,6 • 6,4 ■ 0,2 2,8 9,5 17,9 371,2 14,282 2,585 1,11 I 246 " 1240,3 4,1 15,9 208,9 3,3 11,4 0,6 85,5 6,9 0,3 4,3 19,6 10,5 289,6 7,737 8,316 1,264 247 1077,6 1,5 15,0 130,0 1,4 14,3 0,6 53,7 7,4 0,3 2,9 5,7 61 782,2 6,559 22,4 1,313 248 , 396,4 1,1 6,0 110,5 2,7 9,6 0,8 45,0 7,7 0,2 1,8 15,6 94,5 1061,9 11,498 ,. 117,746 5,287 249 1908,1 2,4 17,6 194,0 1,3 13,7 0,8 46,6 7,5 0,5 6,1 23,4 22,5 523,9 7,597 8,497 1,302 250 1148,4 2,4 14,8 161,2 2,1 11,1 0,5 33,7 7,7 0,3 3,3 18,7 7,1 123,1 5,907 8,799 6,085 251 642,8 1,4 7,9 99,4 2,2 10,5 0,5 39,9 8,0 0,2 1,9 23,4 25,3 394,5 6,886 94,754 13,645 252 1148,0 3,0 14,4 162,6 2,6 10,8 0,6 21,6 7,5 0,5 4,7 9,7 . 39,6 700,5 6,052 9,339 3,553 253 1315,5 3,1 17,2 186,5 2,4 13,9 0,5 16,1 7,9 0,4 4,2 10,0 38 623,3 5,737 3,148 1,021 53 todiky a postupy mikrobiální Zjednodušený princip - II: - chceme vědět, jak j sou si objekty podobné - chceme vědět, zda mají některé parametry podobný průběh mezi objekty - ve dvourozměrném prostoru by tyto věci řešily korelace, regrese apod. - ve vícerozměrném prostoru se použijí speciální algoritmy, většinou jde o: 1) shluková analýza (cluster analysis - CA) 2) analýza hlavních komponent (principal component analysis - PCA) - téměř vždy se pracuje se standardizovanými daty (odečet průměru a vydělení S.D.) 1) Shluková analýza - dendrogram Spojuje "nejpodobnější" objekty a udává "vzdálenost" na níž jsou spojeny, která je mírou této podobnosti. 0.0 diuron+linuron diuron+linuron diuron diuron+linuron diuron diuron chlorotoluron chlorotoluron chlorotoluron non-treated non-treated non-treated Squared Euclidian distance 2.5 5.0 7.5 54 Zjednodušený princip - III: 2)PCA Složitější algoritmus. V podstatě jde o přerovnání rozptylu (přičemž filosofie je taková, že rozptyl = informace) na nové osy tak, aby maximum bylo na první ose (PC 1), maximum ze zbývajícího rozptylu na druhé ose (PC 2) a tak dále. Vzniká tedy nový souřadný kříž. Získáme tedy stejný počet PCs jako bylo původních proměnných, ale rozdílem je, že pomocí pouze např. prvních tří vidíme např. 90% informace. V základu se matematicky jedná o lineární kombinace. Existují ovšem další komplikované postupy -různé rotace kříže, křivení prostoru apod. Dva typy grafů: a) Scores plot ■ - nové hodnoty pro objekty na nových osách vypočítané z lineárních kombinací původních proměnných - zobrazuje tedy objekty - umožňuje vidět podobnost objektů b) Loadings plot - vynáší koeficienty pro jednotlivé proměnné do nového kříže - zobrazuje tedy proměnné - umožňuje srovnat podobnost proměnných a také jejich "zodpovědnost" za jednotlivé PCs, tj. jejich "zodpovědnost" na celkové informaci (podobnosti, odlišnosti apod.) objektů 55 Metodiky a postupy mikrobiální Příklad: • Jako vstupní data použity hodnoty (C-R)/AWCD • Blízkost objektů (vzorků) určuje jejich podobnost O 0 0. -2 GN plates D P ^ A# AA A A -------------------!------------------------j------------------------!------------------------j-----------------------r -8-6-4-2 0 2 PC1 0 - -2 - -4 - -6 -6 ECO plates A A A Q» • BW ■ CB A TC 0 OP a TP A GW -2 0 PC1 T" 2 Fig. 2. Multivariate classification of six aquatic heterotrophic communities, based on carbon substrate utilization in Biolog's GN and EC( plates. Analyses represent principal component analysis of average well color development at 120 h. See explanation of symbols in Fig. 1. "~ ■ ; ~ : ; ~ ; -■ 56 Metodiky a postupy mikrobiální Příklad: • Jako vstupní data použity hodnoty (C-R)/AWCD • Blízkost objektů (vzorků) určuje jejich podobnost .] r Sit« C Sit* B Sit» B Site B Z 1 f Site A Site A Site A Site C Site C Site D Site D Sít» D .1____1____1____1____J. DandroQnni Dlvtuic* .1 — ,1—1 Flg. 2. Cluster analysis ofBIOLOG readings for »oil s&mples collected in the Fall of 1995 from four sites in tine vicinity of a Zn smtelter. Three BIOLOG extractions were conducted per site. Each data point is am average of triplicate plates from eaiľh BIOLOG extraction. Sets of triplicate plates with A WCD values closest to OS were compared in this analysis. Each limit of distance on the dendrogram is equivalent to a difference of 100% on £ single substrate well. t----------1----------r 0 12 3 Principal Component 1 Fig. 3. Principal component analysis of BIOLOG readings for soft samples collected iin the Fall of 1995 from Sour sites in the vicinity of £ Zu smelter. Three BIOLOG extractions were conducted per site. Each dada point is an average of triplicate plates from each) BTOLOG extraction. Sets of triplicate plates with A WCD vaAues closest to 0.25 were compared in this analysis. PC 1 accounted for 31,0% or the variance in the data, and PC 2 accounted for 26.5% of the variance in the data. 57 Metodiky a postupy mikrobiální Příklad: Impact of CArbon and Flooding on Soil Microbial Communities: Phospholipid Fatty Acid Profiles and Substrate Utilization Patterns • Phospholipid fatty acid (PLFA) profiles provide a robust measure that can be used to fingerprint the structure of soil microbial communities, and measure their biomass. • A replicated field trial, with gradients in substrate and 02 availability created by straw incorporation and flooding was used to test the ability of PLFA to discriminate soil microbial communities in different management regimes. • Another objective was to test the usefulness, on a large scale, of some of the proposed interpretations of PLFA biomarkers. • Using a direct gradient statistical analysis method, PLFA profiles were found to be very sensitive to flooding and straw treatments. Table 4. Effect of flooding and straw treatments on common PLFA biomarkers PLFA biomarker Interpretation Effect of experimental treatments T8:2o)6c Monounsaturates Branched (i, a, Me) Cydopropyl 17 & 19 trans/ás 18 & 16 18:lw8c 10Mel8:0 17:l(o6, 17:lio8, il7:Ia>7 Fungal indicator Aerobic indicator [igh substrate indicator jram-positive Stress indicator Associated with slow growth Stress indicator, associated with starvation Type II methanotrophs Actinomycetes Sulfate reducers Decreased 15%a with flooding (P < 0.0 l)b Increased 19% with straw incorporation (P < 0.01) Decreased 10% with flooding (P < 0.01) Increased 8% with straw incorporation (P < 0.01) Increased 5% with flooding (P < 0.01) Decreased 6% with straw incorporation (P < 0.01) Did not respond to flooding Decreased 9% with straw incorporation (P < 0.01) No effect of flooding or straw treatments, Detection limits hinder use Not detected in any plots No effect of flooding Decreased 10% with straw incorporation (P < 0.01) Not detected in any plots a Flood comparison based on 8 flooded and 8 non-flooded treatment plots from the 4 sample dates for which the effects of flooding were significant, for a total of 32 samples per treatment Straw comparison based on 16 straw added and 16 straw removed and burned treatment plots from the two sample dates in 1995 when effects of straw were significant, for a total of 32 samples per treatment b Mean comparisons based on a t-test 180m t 42m t a. UJ «fry '»'.'.........i.....ii ii in mm» removed * jž> incorpoifatest * C. Ill II I I M i III tili i i i I i li j li I 11 ■ i i ÜüÜüüll removed incorporated it burned soil sampling transect incorporated * removed burned rolled S1 Q. UJ ex > a. UJ as .g.'.ftl.M."'.IMi.MM.I.....ffllllllYiij .' - '•• -.-.. • . '• './'removed' |iMlMy<>>ViV<>>ViViXMYiiVé;iSH'iii'j» TO*SÍ i^iY«>>>hYiYih'ÝÍ11 lYiVi 'i iViVi'i "if Wiiif00^í^m 1::;;V''':'- <^j\?^"i g •■::«w* :.•;;•• fe:4r«»fj>brat»rj:.:;*. •^/■■'"'•''mi-ÍImIÍiC--^" removed incorporated * burned removed incorporated * rolled burned * Straw burned and incorporated plots sampled in 1994 All plots sampled in 1995. Fig. 1. Field experiment design and sampling pattern. 58 Metodiky a postupy Příklad - pokračování: T 10 16:1co7c* 1.0 mono/sat 18:1o)7c* • fung/bact* I8:2(06c*" ^^(oe 18:1co9c* • i17:1a>5c H----------i----------1------=-l------ 15:la>6c* 14:0 17:1