Přednáška 6.12.2005 RNDr. Alena Vaculová, Ph.D yfcok met ik y l»ía.rv»hôlm úitcw ilVČn, MNO EŠE Výzkum zabývající se problematikou apoptozyje stále aktuální a rozvíjející se oblastí vědy. Má možnosti široké aplikace jak v základním výzkumu, tak v klinické praxi. Regulace průběhu buněčné smrti patří mezi klíčové funkce nutné pro udržení normálních funkcí organismu. V případě jejího porušení může docházet k nekontrolovatelnému úbytku buněk nebo naopak k jejich akumulaci v organismu (např. při nádorovém onemocnění). Důkladné pochopení mechanismů apoptozyje proto nutným předpokladem pro úspěšnou terapii řady onemocnění. TRAIL selektivní indukce apoptozy u celé řady x. však u větši n v nor iwmíwvimmwitm Husí TRAIL rĽ4ľť|]lL»ruillJ tirtot rtütptoni 4 lÄ ľ' t l>R-í / DR5 IkHl uu 4XÍU in r.Ti r,.. f^ nrpuTTi í DcR2 I ■] i J Kí ŕíi r' A r i li'iUSIiniľiÚ-pi^^fc^iJ *4rfjt*J4j*i (na rozdíl od TNF, Fas) možnost int peti r ^■i v-i i^iiiií ceptory TRAIL-R1 (DR-4, APO-2) TRAIL-R2 (DR-5, TRICK, Killer) TRAIL-R3(DcR1) TRAIL-R4 (DcR2, TRUNDD TRAIL-R5 (osteoprotegenn TRAIL „death receptor" Prokaspáza-8 M FADD Kaspáza-8 Efe kto rove kaspázy Buněčná membrána Mcl-1 Bcl-2 Bax tBid Bak □ Mitochondrie o Cytochrom c dATP o J*D APaf"1 i Kaspáza-9 Dl___U Prokaspáza-9 Kaspáza-6 Kaspáza-3 i i jádro „Death" substráty Ovlivnění citlivosti buněk k účinkům TR na úrovni receptoru nozstvi DRs a DcRs, jejich mutace Bl - na úrovni jednotlivých proteinů v signální dráž jšEMn kaspaza-8, FLIP Smac/DIABLO inhibitory apoptózy (lAPs NF-kappaB Bcl-2 rodina (Mcl-1, Bcl-2, Bax. kinázy Popis signálních drah TRAILu je velmi důležitý pro 7rirai[.]«I:jllBMl:JHlhlllk-1IIHBmiI»B»llk-1»]»raíT mechanismů rezistence a pro správné zacílení orotinádorové terapie Důležitost srovi citlivosti normálních a nádorových buněk - rozdíly v signálních drahách? Na kterých úrovních signální dráhy se projevuje rezistence? Přinese toto srovnání více informací o tom, proč TRAIL selektivně indukuje apoptozu u nádorových buněk a proč je většina nádorových buněk k jeho působení rezistentní? TRAIL „death receptor" Buněčná membrána Prokaspáza-8 M FADD Mcl-1 Bcl-2 Bax tBid Bak □ Mitochondrie Cytochrom c o J*D Apaf-1 Prokaspáza-9 jádro Kaspáz' - cysteinove proteázy, specificky štěpí proteinové substráty v místě kyseliny asparagové - klíčová úloha v přenosu apoptotického signálu - v inaktivní formě (proenzymy, pro-kaspázy), štěpení -aktivní kaspáza schopná dále štěpit tzv. „death substráty" - struktura: - Prodomena - Katalytické podjednotky - velká a malá (heterotetramer) -dělení: - Iniciační kaspázy (dlouhá prodomena) - kaspázy-8, -9 - Efektorové (krátká prodomena) - kaspáza-3 Inactive Proenzyme Q Frodomain J^ Large subunits Í Small ) Aap X Catalytic Sites Active Caspase -Substráty kaspáz: - PARP - poly(ADP)ribosyl polymeraza - cytokeratiny (CK18) -actin, fodrin, lamin -kaspázy - proteiny Bcl-2 rodiny - Bid -kinázy (PKC) -atd. KasDáza-8 - iniciační kaspáza aktivovaná na úrovni signálního komplexu DISC -v DISCu se prokaspáza-8 (55/57) štěpí na kaspázu-8, vznikají fragmenty o velikosti 41/43 a 10/18 kDa (dvoukrokový mechanismus aktivace) - FLIP - inhibitor kaspázy-8, brání její aktivaci, neboť se sám váže do DISCu - aktivní kaspáza může dále aktivovat dvě základní dráhy (přímá aktivace kaspázy-3, dráha závislá na mitochondriích - protein Bid) Caspase-8 ■ initiator caspase ■ pro-caspase-8 (55/57 kDa) is activated in the DISC in an iutoproteolytic manner by two subsequent cleavage steps DED DED p55 I-------M------3 pl8 i i. p43 1 2. p26 Caspase-8 activation plO D i plO plO pl8 pl8 plO TRAIL ????????????? cFLIP tBid / Bei -2 rodina (Bax, Bcl-2) \ FADD TRAIL-R / Caspase-8 Bid Cytoehrom c Caspase-9 Smac/DIABLO-like proteins..... DISC Caspase-3 Death substrates (PARP...) 00 250 200 °- P 150 ■* o jS -* 100 > 0s (0 50 TT kontrola TRAIL experimentální schema - iniciační kaspáza v mitochondriální dráze indukce - aktivovaná na úrovni apoptozomu - signálni komplex: cytochrom c, Apaf-1, prokaspáza-9 - aktivace prokaspazy-9 - stepem - aktivovaná kaspáza-9 dále štěpí (aktivuje) m aboratory ytokinetics f ^ 100 C "■g 100 re 50 0 kontrola TRAIL PolvŕADP-ribosvh polymerase ÍPARP o o Jaderný protein (113 kDa), opravy DN ĺ*j m o 24 kD citlivý marker pro detekci apoptózy Inaktivace PARP blokuje opravu DNA, posílení fragmentace DNA ytokmetics DNA strand nicks massive DNA disruption repair i PARP activation NAD+ Poly(ADP- ' ribosyl)ation PARP OVERACTIVATION NAD+ Poly(ADP-ff ribosyl)ation 4 ATP Energy metabolism Energy failure CELL DEATH kDa 113 89 K TRAIL TRAIL „death receptor" Prokaspáza-8 M FADD Kaspáza-8 Efe kto rove kaspázy Buněčná membrána Mcl-1 Bcl-2 Bax tBid Bak □ Mitochondrie CYTOSKELET o Cytochrom c dATP o J*D APaf"1 i Kaspáza-9 Dl___U Prokaspáza-9 Kaspáza-6 Kaspáza-3 i i jádro „Death" substráty štěpení cytokeratinu 18 -již během raných fází apoptozy dochází ke štěpení důležitých složkek cytoskeletu - cytokeratinu - detekce štěpení cytokeratinu 18 - velmi citlivá metoda detekce apoptozy, obzvláště určená pro epitheliální buňky! - štěpení CK18 efektorovými kaspázami - odkrytí specifického epitopu v nolekule CK18 - marker apoptozy - ten detekován pomocí specifické protilátky, která je fluorescenčně značená Monoklonální Ab proti specifickému epitopu CK 18, konjugovana sFITC TRAIL „death receptor" Prokaspáza-8 M FADD Kaspáza-8 Efe kto rove kaspázy Mcl-1 Bcl-2 Bax tBid Bak □ Mitochondrie o Cytochrom c dATP o J*D Apaf-1 i Kaspáza-9 o<0 l=l Dl___U Prokaspáza-9 Kaspáza-6 Kaspáza-3 i i jádro „Death" substráty PLAZMATICKÁ MEMBRANA Annexin V assa - Detekce translokace (externalizace) fosfatidylserinu v plazmatické membráně (odlišná distribuce u „normální" a apoptotické buňky) - Detekce raných fází apoptózy - dvojí barvení annexin V - FITC, propidium jodid (živé buňky) Anna* conjugate o i o can- Plasma mambrana Apoptosis ---------------► Extamattiatlon of pMůs;pliatitJylsei"iii& •^ Cytoplasm Cytoplasm Schematic representation of tli é Annöxin V assay. ÍĽ o .1 Viable cells Lk. -JÍ i_ J --------1 ■ I " I Annexin V-FITC Dead cells Apoptotic cells PI - rozlišení živých a mrtvých buněk (integrita plazmatické membrány) - annexin-V - pozitivní buňky - buňky s translokovaným fosfatidylserinem (apoptotické + nekrotické) apoptotické buňky - PI-, annexin-V + TRAIL „death receptor" Prokaspáza-8 Kaspáza-8 Efe kto rove kaspázy Buněčná membrána Cytochrom c o J*D Apaf-1 Prokaspáza-9 Kaspáza-9 Kaspáza-6 Kaspáza-3 i i jádro „Death" substráty MITOCHONDRIE centra buněčného dýchání, energetická centra buňky složení: vnější membrána - semipermeabilní (5 kDa), kanálky (porin) vnitřní membrána - nepropustná, pouze selektivní transport, bohatě členěná (kristy - zvětšení povrchu - syntéza ATP), zde ukotveny proteiny - součásti elekron-transportního řetězce, transport elektronů a syntéza ATP intermembranovv prostor (enzymy, proapoptotické proteiny) matrix - vysoce koncentrovaná směs enzymů, DNA, ribozomy, citrátový cyklus »uter mitochondrial in em brané Inner mitochondrial Intermembrane membrane space Matrix High [H+]= low pH © 2003 Thomson ■ Wadsworth Low [H+]= high pH Electron transport leads to proton pumping across the inner mitochondrial membrane MMP normální buňka vs. apoptotická Úloha mitochondrií v aoootóze - Změny v transportu elektronů - Změny energetického metabolismu buňky - Změny v produkci ROS - Změny mitochondriálního membránového potenciálu - Účast proteinů rodiny Bcl-2 (Bid, Bak, Bax...) -Uvolnění proapoptotických proteinů Ado2.7 - 38 kDa protein na membráně mitochondrií -exprimovan u apoptotických buněk, v raných fázích apoptozy Měření mitochondriálního membránového potenciálu Ztráta MMP se hodnotí jako nepřímý důkaz otevření megapórů a zvýšení permeability vnější mitochondriální membrány, které hraje úlohu při vylití některých mediátorů apoptózy z těchto organel. Při analýze MMP se používá fluorescenční lipofilní katión TMRE (tetramethylrhodamin ethyl ester), který se hromadí v mitochondriích v závislosti na MMP. S využitím průtokové cytometrie lze detekovat posun ve fluorescenci TMRE, podávající informaci o změnách MMP. Měření mitochondriálního membránového potenciálu Flowcytometr - po obarvení TMRE Hodnocení % buněk se sníženým MMP control TRAIL Height I Cellular Respiration H20+ 02 Oxidative Burst HoO Protein Peroxidation Environmental Factors Lipid Peroxidation DNA Damage by G.P, Eckert www. biozentm m. uni-f ran kfu rt.d e/Pha rma kolog ie/i ndex .html - 2nd messengers vs. oxidatívni poškození - rozlišovat!!!! ROS vs. TRAIL Měření produkce reaktivních kyslíkových metabolitů (ROS) - průtokový cytometr - Peroxid vodíku - dihvdrorhodamin-123 ÍDHR-123! - dichlorofluorescein diacetat (DCFH-DA) -Superoxid - hydroethidin (HE) II I H I i [l I CD \ o + naše experimenty Q) O 180 150 jj> 120 | 90 :2 30 o rf & H> ^ ^ a> o o O Q. OS 20 15 10 T kontrola TRAIL Detekce fragmentace DNA - TUNEL Pro detekci fragmentace DNA se hojně využívá metody TUNEL (terminal deoxynucleotidyl dUTP-nick labeling). Vzniklé zlomy DNA lze identifikovat pomocí enzymatického značení jejich 3'OH konců nukleotidy konjugovanými s FITC. Velmi výhodné je současné obarvení DNA propidium jodidem, což umožní jak určení celkového obsahu DNA, tak detekci zlomů. Takto lze detekovat, zda indukce fragmentace DNA je specifická pro určité fáze buněčného cyklu. Závěrv - aooDtóza nádorových buněk tlustého střeva do ůsobení TRAILu - plazmatická membrána - změny uspořádání fosfolipidů -fosfatidyl serin - cytoskelet - štěpení cytokeratinů - cytokeratin 18 - cytoplazma - kaspázy, substráty kaspáz - mitochondrie - membránový potenciál, produkce ROS, proteiny Bcl-2 rodiny, apoptotické proteiny uvolňované z mitochondrií, Apo2.7 protein -jádro -jaderná morfologie, internukleozomální štěpení DNA, PARP