YZI IE B CHS Doc. RNDr. Kozubík Alois, CSc. - Doc. RNDr. Hofmanová Jiřina, CSc. ■ oborciloř _ytokinetik y Aiofyzikalnf Ostav AVČft, OANO ročníku fyziologie živočichů a obecné zoologie, mol. biologie, chemie životního ostředí a ekotoxikologie, výběrová přednáška pro doktorandy Stručný úvod do teorie systémů Negativní a pozitivní zpětná vazba Základní pojmy, parametry cytokinetiky (proliferace, diferenciace, apoptóza) - Typy buněčných populací - Kmenové a diferencované kompartmenty. Totipotentní, pluripotentní, progenitorové, komitované diferencované buněčné populace - Autokrinní, parakrinní a endokrinní regulace - Buněčný cyklus a jeho regulace - Faktory ovlivňující buněčné dělení, cytokiny, růstové faktory a inhibitory, jejich specifita a rovnováha jejich působení - Struktura plasmatické membrány a její funkce v regulaci buněčné proliferace a diferenciace - Vysoce nenasycené mastné kyseliny a eikosanoidy - Transdukce signálů a exprese genetické informace - Úloha fosfolipidových komponet v transdukci signálů růst modulujících látek - Mechanismus účinku hormonů a tkáňových mediátorů ( cytokiny a "chalony"). Regulace proliferace, diferenciace, apoptózy oberol ylokineliky BiefyilhAlaf úilov nVČA, ARNO Krvetvorný systém a jeho funkce i Hemopoéza (lymfopoéza, myelopoéza, erytropoéza, megakaryocytopoéza ) J Funkce diferencovaných krevních elementů - monocyty, makrofágy - fagocytóza; T B lymfocyty - imunita i Membránové rozpoznávací systémy buněk imunitní soustava i Tvorba protilátek ( mechanismus a dynamika vzniku, příprava monoklonálních protilátek ) J Sekreční a regulační funkce buněk imunitního systému i Vztah imunitního systému k dalším fyziologickým funkcím ( zánětu apod.) Homeostáza, zdraví a nemoc i Organismus jako hierarchický systém, spolupůsobení nervové, endokrinní a humorální soustavy i Příklady systémových reakcí jako jsou stres, zánět apod. a jejich význam z hlediska zdraví a nemoci i Škodlivé faktory vnějšího prostředí a jejich vliv na zdraví lidské populace oberol ylokineliky BiefyilhAlaf úilov nVČA, ARNO ručená I Cell Physiology Source Book, ed. N. Sperelakis Academic Press Inc., 1995 B. Alberts et al.: Molecular Biology of the Cell, 3rd edition, Garland Publish. Inc., New York 1994 Biochemie, B., Voet, J.G. Voetová: Victoria Publishing, Praha, 1990 Molecular Cell biology, J.E. Darnell: Eds. Darnell, Lodish, Baltimore, 2nd edition, Scientific American Books Inc., New York 1990 J. Neuwirt, E. Nečas: Kmenové buňky a krevní choroby, Avicenum Praha 1981 Základy buněčné biologie - úvod do molekulární biologie buňky, B. Alberts, D. Bray, A Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter, Espero Publishing, (orig. 1998) linická imunologie, J. Krejsek, O. Kopecký, Nucleus HK, 2004 J. Vácha: Problém normálnosti v biologii a lékařství, Avicenum, Praha 1980 J. Šterzl: Imunitní systém a jeho fyziologické funkce, Čs. Imunol. Společnost, Praha 1993 oboral ylokineliky BiefyilhAlaf úilov nVČA, ARNO množství informace (kvant i (kvalita) využitelnost informace cas „Moudrost člověka lze měřit podle starostlivosti, s níž myslí na věci budoucí nebo na konec." G. Ch. Lichtenberg ytokinetiky niofyzikälní ústav AVČft, RÁNO experimentální základna REGULACE BUNĚČNÉ KINETIKY (PROLIFERACE, DIFERENCIACE A APOPTOZY) na úrovni 1 - molekulární 2-buněčné 3 - systémové (organismus, populace, ekosystém) ciberciloř ytokinetiky Riofyzlkólnf Oslov AVČR, ARNO organismální, studium na jednotlivých úrovních organizace systému cibercileř ytokinetiky Aiofyzikální ústav AVČft, ARNO VÝZKUMNÉ CIL I PRAKTICKÉHO VYUŽIT ONKOGENEZE fáze: 1 INICIAČNÍ PODPŮRNÁ (INITIATION) (PROMOTION) POPULACE NORMÁLNÍCH (NETRANSFORMOVANÝCH) BUNĚK ,cell signalling" (cytokiny vs. eikosanoidy) POPULACE ITRANSFORMOVANÝCH BUNĚK klinická data, PROGRESIVNÍ FÁZE (PROGRESSION) -laboratoř ytokinetiky nloryzikólnr ústav I1VČA, ARNO ciborcit ylokineliky Typy regulací růstu a buněčných funkcí) 1) Hormonální (endokrinní) regulace Regulátor- hormon j e produkován buňkami žláz s vnitřní sekrecí do krevního řečiště Ovlivňuje funkce buněk, které mohou být značně vzdáleny od míst syntézy hormonu. Hormon - je tedy produkován za účelem kontroly činnosti buněk než těch, které jej produkují 2) Parakrinní regulace Mechanismus působení spočívá v tom, že růstový faktor (regulátor) - tkáňový mediator (regulátor místního působení) -je syntetizován jedním typem buněk, poté je transportovan do extracelulárního prostoru a ovlivňuje f-ce buněk v nejbližším okolí. (často jediná možnost vzhledem k velmi krátkému poločasu rozpadu) 3) Autokrinní regulace je možná tehdy, jestliže jsou buňky schopny jak syntetizovat tak i reagovat na určitý (růstový) regulátor. Pozn.: autokrinní model je součástí konceptu vysvětlujícího abnormální regulaci nádorového růstu. Předpokládá, že nádorově změněné buňky produkují stimulační růstové faktory v nadměrném r^ají. Tak se autostimulují ve smyslu aktivace proliferace ApOptÓza: programovaná buněčná smrt, nevede k zánětu Nekróza: neprogramovaná buněčná smrt, je příčinou zánětu (odlišný průběh biochemických reakcí, rozdílná morfologie) Proliferace: i e ekvivalentem buněčného dělení Zvýšení pOČtl1 kvalitntivnč tntnŤnvfh hiinpV^ Diferenciace: „rozrůzňování buněk" (vznik kvalitativně odlišných buněk) Růst zvětšení „objemu" buňky, buněčné populace (tkáně nebo organismu). Je důsledkem: a) zvětšení velikosti buněk při zachování konstantní velikosti pop b) zvětšení počtu buněk (proliferace) bez změn v objemu buněk c) zvýšení po čtu buněk i jejich objemu d) odumírání apoptózou nebo nekrózou oberol ylokineliky BiefyilhAlaf úilov nVČA, ARNO expandující, neopouštějí populaci, mnozí se N íi\ TYPY BUNEČNÝCH V^ ^^ V^ ■ ■ ■ A ^^ ■ NÁDOR POPULACI podle Gilberta a Lajthy(1965) B. C.N.S. stacionární L c. konstantní cytokine tiku iofuzikólní úslov flVČft, MINO TYPY PROLIFERUJICI populace coby zdroj buněk pro jiné populace c. konstantní tranzitní populace ve které se buňky pomnoží c. konstantní TYPY NEPROLIFERUJICI stále ubývá typ průchozí (tranzitní) c. konstantní Tabulka 1 Dělení buněčných populací podle intenzity obnovy u dospělé myši 1. Statické populace bez známek obnovy během života: neurony všech typů srdeční svalové buňky odontoblasty Sertoliho buňky 2. Velmi pomalu se obnovující buněčné populace: Během života se obnoví jen část populace: hladké svalové buňky gliové buňky osteocyty buňky ledvinných tubulů buňky dřeně nadledvinek hlavní buňky žaludeční sliznice intersticiální buňky Leydigovy buňky hnědé tukové tkáně 3. Rychle se obnovující buněčné populace: A. Ne příliš rychle se obnovující populace. Populace, která se během života zcela obnoví, ale za dobu delší než 30 dní: hepatocyty a litorální buňky epitelová výstelka dýchacího traktu buňky slinných žláz buňky pankreatu buňky v kůře nadledvinek parietální buňky žaludeční sliznice pojivové buňky v kůži B. Velmi rychle se obnovující buněčné populace. Všechny se obnoví za dobu kratší než 30 dní: střevní epitel krvetvorné buňky, prekursory krevních buněk epidermis kornea epitelová výstelka ústní dutiny a esofagu povrchový epitel žaludeční sliznice seminiferní epitelová tkáň C. Buňky nádorové oborolo y tokinctik y Ifciofyzikálnf ústav OVCA, BAŇO MODELY: Buňky tzv. intenzívně pro life ruji cích populací zeiména b. krvetvorné a \n EzJ řevních eoitelů uňky nádorové ■ oberoleř ylokineliky The early acting growth factor which maximises host defense * Myeloid Stem Cell Igm-csf IL-3 Proerythroblast (-o Megakaryocyte Erythrocyte *** Platelets Neutrophilic Myelocyte Igm-csf -CSF Promonocyte I GM Jc-c Polymorpho- nucleated Neutrophil IGM-CSF M-CSF Eosinophilic Myelocyte IGM-CSF L-5 IGN Basophilic Myelocyte »oc If Monocyte Igm-csf Lm-csf Eosinophil Macrophage I1L-3/IL-4 é Basophil e~ Mast Cen Polyklonální charakter kostních buněk Přirovnání kmenové buňkv ke stromu: a - kmenová buňka v embryonální době b - kmenová buňka v dospělosti Seznam používaných zkratek kmenových buněk: BFU-E - burst forming unit - erythroid (jednotka vytvářející explozivně vznikající kolonie erytroidní řady). Velmi nezralá kmenová buňka erytroidní řady. CFU-B' ilonv formina cell - B - Ivmfocvte (buňka vvtvářeiící k olorjJB lyrrrfQcyiLMEM I colony forming unii - culiur^^äSSSiM W^jgtgm^g kuliuŕs) m mam )FC - granulocyty macrophage-colony forming cell (buňka vutvářející lie pro granulocyty a makrofágy). ony forming unit - erythroid (jednotka vutvářející kolonie erytroidní řady. nenová buňka erytroidní řady CFU-Meg- colony forming unit - megakaryocyte (jednotka vytvářející kolonie megakaryocytu Kmenová buňka erytroidní řady. SUES 33SDB 33JTJJI jSgjrawBrtjijgraiigR leen (jednotka vytvářející kolonie ve Ise :ratka pro hemopoetickou pluripotei miaiiraiwifiwiuiiam afijjfifi ■ oboroloř ylokineliky niofVzik^kinf úsiov nvcnr aano T.M.Dexter and M.Moore STEM CELL COMPARTMENT PROGENITOR CELL COMPARTMENT MATURE („END«) CELL COMPARTMENT Pluripotent Self-renewing gjsiü C'slls Pre-T cells Eos-CSF T-cells SELF-RENEWAL CAPACITY Fig. 1. The structure of the hemopoietic system Pre-B cells M CFU-E "^ Eosinophils RBC -► Neutrophil Macrophages -► Megakaryocy tes/ Platelets "^ Basophils/Mast cells B-cells DIFFERENTIATION AND DEVELOPMENT ,MY-1JS ylokineliky Riofyzikólní úslov RVČR, ARNO Kompartmenty funkčně nebo prostorově oddělené soubory prvků (složek). Důsledek kompartmentace: (existence jednotlivých kompartmentů) prvky (např. látky nebo buňky) jsou nerovnoměrně rozděleny. Příklady: všechny membránami ohraničené struktury mají (z hlediska rozdělení látek) „své vnitřní prostředí" a selektivně akumulují nebo zadržují určité látky proti koncentračnímu spádu. Už tímto prostým faktem jsou některé reakce umožněny, jiným může být zabráněno. Tato protientropická distribuce molekul v buňce směřující proti neuspořádanosti má velký význam pro buněčný metabolismus a regulace. Umožňuje ji právě existence buněčných membrán -jeden ze základů biologických systémů Bude rozvedeno později ■ ciborcitoi ylokineliky niofVzik^kinf úsiov nvčn, aano >4> >d 2 •a e O s 100°/ 50% 0% CFU-S "Pluripotentní buňka již neschopná vytvořit slezinnou kolonii BFU-E CFU-E CFU-C CFU-eozinofilů CFU-Meg CFU-makrofágů2 CFU-BL3 CFU-TL3 erytroblasty myelocyty megakaryocyty I o t Plh Pluripotentní buňky Morfologicky rozpoznatelné buňky -x- Proliferující buňky Neproliferující buňky Obr. 8. Schéma kvantitativního zastoupení různých prekurzorů krevních buněk v krvetvorné tkáni. !Podle Gregorové a Henkelmana (1977); 2podle MacVittieho a Porvaznika (1978); 3nejsou odvozeny od CFU-S. ciborol Vlokineliky ikólní úslov nVČR, ARNO oborcitoř ytokinetiky Biofyzikálni úslov RVČR, BRNO "S s í XD c o. « ^ 3 o O O. c C O .& o (0 •3 Q. 1, o »o x» "O Si 0) O i5 E 0) N Q. >o c o o c o o £ »c S. s- *» SE a. srn ■^J^ IP O 3 u c i; ^ íL> > 3 í X -> 'f~> 2 § G) >> 2 o ■o _l_ c *» i O A E c T íl ^3 O í? -! iJ____ nevratného —' cU cD cií pu^Áu'Z^ní ■'-> i J iľ ~P Tz! • r ^ i rovn o si víjž/jý BJV íjarovnovážíjý stav "■ ^IJ• I • 11 "UJ ftiofuzikólní úslciv UVER, ftftNO treatment: ovlivňovaný systém parametry cytokinetiky: 1 cytostatika, | ozařování, .. proliferace 1^* "black box" i á ^ ^^ 1 ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ 1 regulační lpodněty,atd. ]~> s diferenciace * ^ ^^* apoptóza 1 "0" r VSTUPY modelové systémy in vitro, buňky lišící se růstovou "strategií", pacient 1 VÝSTUPY differentiation /^ ^ apoptosis proliferation i ^^^^^ (necrosis) Rovnováha (homeostáza) výsledek působení mnohocetných zpětných vazeb joboroloř ytokinctiky ßiofyzikolni úslov IWČft, ftftNO FAKTORY SPECIFICKÉ + FAKTORY NESPECIFICKÉ membrána cytosol REGULACE „NORMÁLNÍHO" RŮSTU Poly- Oligo- Mono- INHIBICE kumulace katabolitů vyčerpaní živin transmem.pot. Em -70 až -90 mV limitní konc. Na+/K+, Ca2+, Mg2+ snížení cGMP~10-8-10-12 mol.ľ1 intracel. ;enícAMP10-2-10-5mol.ľ1' katabolické steroidy interferon katecholaminy, adrenalin některé mitostat. hormony ACTH některé prostaglandiny inh. myeloidní leukémie inh. epid. karcinomu, ascitu inh. lymfomu, melanomu epidermální, intestinální inh. :GRF, MCIF inh. Atd. BSC-1,BHK-1 inh spec. inhibitory-chalony spec. endogenní inhibitory Startovací stimulátorová síla (odpověď vše nebo nic) _________i_________ spec. intracel. stim. proteiny spec. růstové faktory růstové proteiny, kondic n poietiny, CSF lektiny (A, conc. A) somatomediny některé prostaglandiny EGF, FGF, NGF, MSAatd. některé hormony - mitogenní inzulín, serotonin hydrokortizon, noradrenalin anbolické steroidy zvýšení cGMP 10-3-10-6mol.ľ1 extr snížení cAM dodání Ca^+nad 1,8 mV transmem. pot. Em -10 až -70 mV proteázy, trypsinizace dodání živin odstranění katabolitů Mono- Oligo- Poly- Startovací inhibitorová síla (odpověď vše nebo nic) STIMULACE 1A Schematické znázornění stimulace í i inhibice růstu specifickými a nespecifickými faktory. Převaha pozitivního nebo negativního sign álu rozhoduje o výsledné stimulaci nebo inhibiciů závisí na metaboluické a růstové aktivitě buněk, typu buněk a dalších podmínkách - viz text. Specifické růstové účinky vněj šího pro středí buněk zahaj uj í specif ické růstové faktory (specificko stimul8tory) a specifické endogenní inhibitory (chalony). CSF-kolonie stimulující faktor, EGF-ep idermální růstový faktor, FGF-fibroblastový růstový faktor, NGF-nervový růstový faktor, MSA-n mltiplikaci sti- mulující aktivita, cAMP-cyklický 3'5 -£ ^uanosinmonofosfát, BSC-1, BHK-1, MCIF, FGRF-specifické inhibitory daných buněčných linií. ciborol ylokineliky niofVzik^kinf úsiov nvčn, aano "S s í XD c o. « ^ 3 o O O. c C O .& o (0 •3 Q. 1, o »o x» "O Si 0) O i5 E 0) N Q. >o c o o c o o £ »c S. s- *» SE a. srn ■^J^ IP O 3 u c i; ^ íL> > 3 í X -> 'f~> 2 § G) >> 2 o ■o _l_ c *» i O A E c T íl ^3 O í? -! iJ____ nevratného —' cU cD cií pu^Áu'Z^ní ■'-> i J iľ ~P Tz! • r ^ i rovn o si víjž/jý BJV íjarovnovážíjý stav "■ ^IJ• I • 11 "UJ ftiofuzikólní úslciv UVER, ftftNO oborcitoř ytokinetiky Biofyzikálni úslov RVČR, BRNO růstové signály receptory ciborotoř ytokinetiky Riofyzikální úslov AVČA, URNO CSF-1 receptor substrates e.g. PI-3 kinase phospholii G proteins (ras/GAP?) oberoler ytokinetiky Na+ Oncogenes Growth factor! fgf-5 hst SIS int-2 Receptor bek fms erb B mas fkg ros G protein rab ras ral Tyrosine kinase abl erb met B2/neu ret fes/fps sea fgr src trk fyn kit yes Ick Serine kinase |_| mil/raf pks mos raf pim-1 rel Nuclear fos myc jun ski rnyb______ Growth factor Receptor Transducer Effector 2nd messenger Target Regulatory proteins RNA/protein synthesis DNA synthesis According to: G.Powis: TiPS; 12: 188 -194, 1991 Receptor« Receptoj^^_ Roroptnr Receptor Y Y Y m G protein G protein G protein ^ I \ \ > .Receptor_ PLCy________PLA2___Na7H _ AdenylyL_m tyrosine^--^ A v antiport cyclase kinase /\ Arachidonate I I * * /A * * ° DG IPs^ICa2! pG TX [pH], cAMP^g //IN t 1 CO O PKC PK(?) Calmodulin j PKA —k______i________i____L^ -+ c o I-m -►s Epigeneticky působící faktory, které mohou modulovat rychlost dělení, diferenciaci anebo zánik buněk Faktory, které mohou ovlivnit cytokinetiku změnami 1) exprese anebo funkce molekul zapojených v přenosu signálů přímo regulujících proliferaci, diferenciaci a buněčnou smrt (apoptózou), včetně exprese protoonkogenu a nádorově-supresorových genů 2) signálů, které tyto funkce ovlivňují do určité míry nepřímo jako jsou inhibice mezibuněčných spojení, o řunkce enzymů reparujících DNA, _ oberol _ _ ylokineliky BiefyilhAlaf úilov nVČA, ARNO Modulace cytokinetiky latkami tukové povahy Lipidy a zejména jejich složky vysoce nenasycené kyseliny (PUFA), včetně jejich metabolitu eikosanoidu, jUal MM|gll|l|l2M2^ ivni eie all ,ormainic, ale i transformovaný! transformace y^^p ■ ciborcitoi ylokineliky f*iofVzik*lni úslov ilVČn, AANO Hlavní mechanismy působení PUFAs 1) přímé ovlivnění aktivity transkripčních fakto regulujících expresi genů významných z hlediska cyto kin etiky 2) produkce eikosanoidů působících na přenos signálů cytokinů a imunitní systém •eaktivních kyslíkových metabolite eroxidací lipidů. oberol _ ylokineliky BiefyilhAlaf úilov nVČA, ARNO lam rovnováhy v ořísunu d rekursorovvch PUR v produkci jednotlivých jejich metabolitů oberol ylokineliky BiefyilhAlaf úilov nVČA, IkHMO LU O < LU O Q. n-6 n-3 n-9 KONCENTRACE MASTNÝCH KYSELIN D.G.Cornwell and N.Morisaki. Free Radicals in Biology. Vol.6. 1984 Vlokineliky ■kôlni úslov nVČR, ARNO 1 J ^ O LU ^r Q O ^r Q. < _ f j £ ^^^^^■^■^^^^^^^ ^r LU U. /—^^ LU -J ^r ^^^^^ < o ^r ^^^^ Q Q. ^y \ x o LU Q. r 1-6 _________________________________J n-3 n-9 KONCENTRACE MASTNÝCH KYSELIN 1 D.G.Cornwell and N.Morisaki. Free Radicals in Biology. Vol.6. 1984 ■ oboralo Vlokineliky ■kôlni ústav RVCR, ARNO LU O < LU O Q. >- Z O z < < H C/) o a. n-6 KONCENTRACE MASTNÝCH KYSELIN D.G.Cornwell and N.Morisaki. Free Radicals in Biology. Vol.6. 1984 .oboral _ ylokineliky f*iofVzik*lni úslov ilVČA, AANO MEMBRANE PHOSPHOLIPIDS PLA2 COOH CYCLOOXYGENASES I EPOXYGENASES (P450) LIPOXYGENASES I oboroloř y tokinetiky f»iofyzik*lní úslov flWČIl, fftftNO Arachidonic acid: metabolic pathways and its possible modulations ■ MEMBRANE PHOSPHOLIPIDS I INDOMETHACIN DICLOPHENAC ETYA CYCI ,O0 XYGENASES ARACHIDONIC ACID •<■•....... I ■ f SKF525A, 9-HE PROSTAGLANDINS THROMBOXANES PROSTACYCLINS N, P450-MONOOXYGENASES abbreviations: ETYA = = 5,8,11,14-eicosatetraynoic acid ESC = esculetin NDGA = nordihydroguaiaretic acid FLAP = 5-lipoxygenase activating protein 9-HE = 9-hydroxyellipticin HETEs = hydroxyeicosatetraenoic acids HPETEs = hydroperoxyeicosatetraenoic acids EETs = epoxyeicosatrienoic acids SKF525>ö ^ = proadifen 12-LiPOXYGENASE 5-LIPOXYGENASE #^ ir+ 12-HETEs LEUKOTRIENES FI .AP MK-886 (^-LIPOXYGENASE; o growth factors hormones O receptor PLA PLA,------^ AAAMAAA ♦VVWWVV 1 AA cyclooxygenases lipoxygenases CP450 monooxygenases ..... 1 eicosanoids L__ ■ion channel activity ■ guanylate cyclase ■ adenylate cyclase ■ protein kinase C ■ protein kinase A ■ tyrosine kinase ■ MAP kinase ■ G-proteins ■--*v. transcription factors i gene expression cell growth According to: A. Sellmayer et al. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids ; 157,1997. oborot ylokineliky