FYZI gggi IE B ML CHS Doc. RNDr. Kozubik Alois, CSc. - Doc. RNDr. Hofmanová Jiřina, CSc. ■ oborciloř _ytokinetik y Aiofyzikalnf Ostav AVČH, AANO oboral ylokineliky f*iofVzik*lni úslov ilVČA, AANO proliferation time (t) ytokinetiky Biofyzikálni Oslov AVČA, AANO 1jjHjj?1 dJ'ffaľaiJ'i: •o/rxSm«] unknown leukemia stomach [prostate |lung brain [renal| ovarian 35 id n pmíSSSS BT 33iH3i breast liver ||F Figure 7-3. Molecular Biology of the Celí, 4th Edition. (A) human brain (B) human liver 03 eg u Di "- - •> m P ■■ •*' *-* A k ■ VI | - * -*- * - - • 4 -... * ■ * ■ 4a ■ • • * - * - - ■ * m- -* « - 4 fc » ' m * t - * ^ _i ^P p ♦ tt_ • -» * A.. * * ■ * *«L J» • ■■ ■ ^^ ■ * 4m ^ • w "••••■• """ A • ■ - . 7 * - J * * *■ - -> * 4 .! . »* .# - - ^* * ,, " *4 * ^ ■ ^ * - **w»»r r "- "* -^ f* 4« :* . - * acidic isoetectric point basic Figure 7-4. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition Polyklonální charakter kostních buněk Obr. 1. Přirovnání kmenové buňky ke stromu: a - kmenová buňka v embryonální době b - kmenová buňka v dospělosti ■ oberalo ylokineliky BiefyilhAlaf úilov nVČA, ARNO >4> >d 2 •a e O s 100°/ 50% 0 CFU-S "Pluripotentní buňka již neschopná vytvořit slezinnou kolonii BFU-E CFU-E CFU-C CFU-eozinofilů CFU-Meg CFU-makrofágů2 CFU-BL3 CFU-TL3 erytroblasty myelocyty megakaryocyty I o t vi Plh Pluripotentní buňky Morfologicky rozpoznatelné buňky -x- Proliferující buňky Neproliferující buňky Schéma kvantitativního zastoupení různých prekurzoru krevních bunék y krvetvorné tkání !Podle Gregorové a Henkelmana (1977); 2podle MacVittieho a Porvaznika (1978); 3nejsou odvozeny od CFU-S. ■ ciborolo Vlokineliky ikólní úslov nVČR, ARNO The early acting growth factor which maximises host defense * Myeloid Stem Cell Igm-csf IL-3 Proerythroblast (-o Megakaryocyte Erythrocyte *** Platelets Neutrophilic Myelocyte Igm-csf -CSF Promonocyte I GM Jc-c Polymorpho- nucleated Neutrophil IGM-CSF M-CSF Eosinophilic Myelocyte IGM-CSF L-5 IGN Basophilic Myelocyte »oc If Monocyte Igm-csf Lm-csf Eosinophil Macrophage I1L-3/IL-4 é Basophil e~ Mast Cen Buněčné komponenty hematopoetického mikroprostředí (H.I.M.) v kostní dřeni (K.D.) (podle Knospeho 1978) UfflJjJJJ^^S ■^SroiSPjVfjT^L^^^^J ^^^^^^^^^^ffl ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ fl uvolňování zralých buněk do cirkulace, 50UC£i3'í rnikíODí03iř9u] urno^nuiíci ,oun3cnou oroli ršitsTSt^l ^^^^^^fl ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^M Tuko/š buňky roS^^H^^^^n^^^fflS^^Bsxní drsni ^^^^^^^^^^g ^m GM progenitor cell ++ 4...... M-CSF *••... IL-6 GM progenitor cell €)£)€) QQQ mature granulocytes €)© 2s mature ^5-X granulocytes mature macrophages myeloblast mature granulocyte mature granulocyte v ^ superoxide phagocytosis (a) cell production is dependent on regulator stimulation (b) induction of commitment to form cells in a restricted lineage The role of IL -1 in hematopoiesis (jiný př.) 1. monocyte production and activation 2. proliferation of committed progenitor cells (BFU-E, CFU-GM) clonal expansion of differentiated B - cells IL-1 I T-cells endothelial cells fibroblasts epithelial cells 1. T- cell growth 2. Ig secretion 1. neutrophil activation 2. neutrophil production 3. stem cell activation adhesion of leukocytes to other cells ELAM - endothelial leukocyte adhesive molecule ICAM - intercellular adhesive molecule Network of cytokine interaction IL-4 G-CSF Antibody Bone marrow Autoregulace uvnitř systému granulocytu - makrofágů CFU-C (GM - CFC) CFU-C CFU-C CFU-C O -oN 0, CSF -^ / \ <— CSF / PGE2 / \ \ CSF : 0/ \|© /\\ ™ 0 0 \© 0 0i0 A různé koncentrace CSF B zpetnovazebna stimulace —> produkce inhibitoru a inhibice PGE-----> tvorby CSF G - granulocyty M - makrofagy rozdílné chemické povah The four important families of small organic molecules in cells »Be building blocks of the cell SUGARS FATTY ACIDS^ AMINO ACIDS NUCLEOTIDES larger units of the cell POLYSACCHARIDES FATS, LIPIDS, MEMBRANES PROTEINS NUCLEIC ACIDS ] Figure 2-17. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. Oncogenes Growth factor! fgf-5 hst SIS int-2 Receptor bek fms erb B mas fkg ros G protein rab ras ral Tyrosine kinase abl erb met B2/neu ret fes/fps sea fgr src trk fyn kit yes Ick Serine kinase |_| mil/raf pks mos raf pim-1 rel Nuclear fos myc jun ski rnyb______ Growth factor Receptor Transducer Effector 2nd messenger Target ]_ Receptor« ReceptoL. i G protein ReceptoL. Regulatory proteins RNA/protein synthesis DNA synthesis ■Receptor_ PLCy. tyrosine^ kinase G pro _ PLA. Dtein . ReceptoL i G protein A Arachidonate antiport cyclase Na7H _ Adenyly antipc late I /A .7. m Do > -z. m / PKC PK(?) Calmodulin J. 1 ▼ o MP^H DG IP3_^[Ca2Y pG TX [pH]i cAMP_o \ I % 1 PKA i___U c o I-m -►s According to: G.Powis: TiPS; 12: 188 -194, 1991 ciborcitor ytokinetiky Riofysikólní ústov AVČR, ARNO strukturní úloha FOSFOLIPIDU V BUŇKÁCH Přirozené funkce membránových lipidů FUNKČNÍ TRUKTURN REGULAČNÍ) CYCLOOXYGENASE S MEMBRANE PHOSPHOLIPIDS PLAo COOH IrxB o A^s= I EPOXYGENASES (P450) LIPOXYGENASE S ".TAJ [EPOXYACIDS, DIOLS, etc. PGE2: LTC, SSSff /x__ Itb| LTC4 \ LTD4 i s COOH NHCH2 LTE4 1 COOH NH COCH2CH2CHCOOH Ltf Signal transmission systems fifo^ PLA2 1 ATP CAM P IP3 arachidonic acid (AA) / ... receptor ^^^^^^ ^^^^^^ \^^^^^ prostaglandins (PG) G-protein leukotrienes oboral ylokinelikv f»iofVzikcftlní úslov flVCfl, ARNO Negative effect on cell proliferation- an example Phorbol esters CSF-1 i poooopoopoc^ PKC PKC GM - CSF EFFECTOR e.g. G protein, kinase RESPONSE IL-3 w PGE2 0 IIIIIIIIIIIII adenylyl cyclase cAMP PKA Q? 0 ► DNA synthesis cell cycle phases 22 Phospholipase C Phospholipase A2 lns(1,4,5)Pj DAG Ca2+ Phospholipase D DAG Transient PKC activation Sustained PKC activation _____i i____ Early responses e.g. Secretion Release reaction ľ Late responses e.g. Proliferation Differentiation Protein kinases and phosphatases ciborcit Vlokineliky niofVzik*lni úslov »VCR, BRNO oboral ylokineliky f*iofVzik*lni úslov ilVČA, AANO rozdílné chemické povah SIGNAL (e.g. cytokines) signal cascade membrane fluidity TL V intracellular functions \ proteins membrane phospholipids nuclear receptors transcription factors ÍNFkB. PPAR. AP-1...) / secretion I 1 \ insertion -3 PUFAs inhibition (NSAIDs) dietary n-6 PUFAs ÍAA. LA) ej'acellular stimuli (cytokines, hormon pollutants, irradiation o growth factors hormones O receptor PLA AAAMAAA .VVVVVVVV I AA According to: A. Sellmayer et al. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids ; 57: 353 - 357, cyclooxygenases lipoxygenases CP450 monooxygenases eicosanoids L__ -ion channel activity - guanylate cyclase - adenylate cyclase - protein kinase C - protein kinase A - tyrosine kinase - MAP kinase - G-proteins ■ —*v. transcription factors i gene expression cell growth Arachidonic acid: metabolic pathways and its possible modulations MEMBRANE PHOSPHOLIPIDS INDOMETHACIlt DICLOPHENAC ETYA ARACHIDONIC ACID CYCLOOXYGENASES ^.......... f SKF525A, 9-HE PROSTAGLANDINS THROMBOXANE PROSTACYCLIN S X P450-MONOOXYGENASES abbreviations: ETYA = 5,8,11,14-eicosatetraynoic acid ESC = esculetin NDGA = nordihydroguaiaretic acid FLAP = 5-lipoxygenase activating protein 9-HE = 9-hydroxyellipticin HETEs = hydroxyeicosatetraenoic acids HPETEs = hydroperoxyeicosatetraenoic acids EETs = epoxyeicosatrienoic acids SKF525A = proadifen---------------------------- 12-LIPOXYGENASE #* 12-HETEs 12-HPETEs 5-LIPOXYGENASE #* LEUKOTRIENES FLAP EETs HETEs DIOLS MK - 886 fl5-LIPOXYGENASEj Figure 1 PRODUKTY LIPOXYGENÁZ A CYKLOOXYGENAZ Esculetin Indomethacin o !_ +■» C o £ c o 90 ■- 70 ■- 50 ■- 30 ■- 10 ■- -10 -- -30 -- -50 -- -70 -90 *£- 10 30 100 0,3 1 10 30 koncentrace (|xM) koncentrace (|xM) Ibuprofen NDGA E c o 90 J 70 ■ 50 ■ 30 ■ 10 - 10 í L^^=—° 30 , í^ 50 ! r "v 70 - >-^e> 90 - ---------1---------1----------1---------1 o !_ +■» C o 1 10 30 100 0,3 1 10 30 koncentrace (|xM) koncentrace (|xM) VORE et al., J. Immunol. 11,435-442,1989 effect lipoxygenase inhibitors differentiation agents + (MK886, esculetin) + (TPA, RA, DMSO) cell membrane cytosol cell cycle turnover unknown well documented some interactions ofTGF-ß1 andAA metabolism with other regulatory molecules which should be studied (unknown effects) cfeborcilor ytokinetiky Biofyzikálni ústav RVČR, BRNO MEMBRANE PHOSPHOLIPIDS CYCLOOXYGENASES P450 9 PROSTAGLANDIN THROMBOXANES PROSTACYCLINS 12-LIPOXYGENASE ESC 5 - LIPOXYGENASE # FLAP MK-886 (15-LIPOXYGENASE) Ovlivnění metabolismu eikosanoidů I. dodáním exogénni kyselimy arachidonové (AA) II. ovlivněním produkce eikosanoidů s využitím inhibitorů: LPO nebo CO nebo P450 ▼_________________ TNFa TGF-ß-,/ TNFa TGF- ß1 TNFa TGF-ß-,/ TNFa diferenciace (+) po indukci do: granulocytů nebo monocytů -makrofágů diferenciace apoptoza (nekrózaH % čas (t) Vytvoření souboru dat detekcí proliferace, diferenciace a apoptózv u buněk v definovaných časových intervalech Zhodnocení dat: vymezení významných interakcí pomocí matematické analýzy dat upřesnění modelových exp. podmínek pro detailnější studium mechanismů Ytokinetiky Biofyzikálni Oslov AVČR, URNO S-E ej ^-H •S O O w S Factor 2 -concentration Factor 1 - concentration An example of interactions of two factors (data from Eur. J. Pharmacol. 316, 349-357, 1996, see Publications.) Nutrient/GF Deprivatio ?Heat Mitogens GrowtlJ Factors Hormones Serum Environmental Stress UV light Ionizing Radiation Chemotherapy Xenobiotics 02, TM, Heat S phase Replication According to: Rizzieri: Drug Resistance Updates; 1: 359 - 376, 1998 iciborcitoř ytokinetiky Biofyzikálni úslov AVČA, HANO proliferation time (t) ytokinetiky Biofyzikálni Oslov AVČA, AANO materiální zázemí, finanční zdroje, atd. materiální zázemí, finanční zdroje, atd. laboratoř ytokinetiky ftiofyzikalní ústov AVČA, URNO některá OBECNÁ VÝCHODISKA, DŮLEŽITÁ PRO POSTIŽENÍ CHOVÁNÍ A SMĚROVÁNÍ BUNĚČNÝCH POPULACÍ, Z NICHŽ LZE VYCHÁZET, MOHOU BÝT TATO: achování rovnováhy v nejširším slova smvslu mezi nrodukrí huněk (intenzitou proliferace) a jejich úbytkem (např. smrtí apoptozou) je podmínkou pro zachování homeostázv na tkáňové úrovni. r> n ÍH if s] JIH fzltjtmsmsl ŽlŽ] M C«M^ >!>■ >11 M>1 iTšTTU podnětů, jež mohou tyto procesy ovlivnit, lze chápat jako integrální ukazatele porušení této homeostázy. Vhodný způsob detekce těch změn, které vedou k trvalejšímu porušení rovnováhy mezi produkcí a úbytkem buněk může celkově odrážet nejen poruchy, které jsou základem tzv. proliferativních chorob (nádorových onemocnění), aje být i ukazatelem nrocesů vedoucích k obnově porušené rovnováhy. UeSShS^IM \TrMrÁímn*E\i\i ii*inmwt^Uuu[iiiiHtimiYi m^nimETi Eül nejen teoreticky orientovaných pracovníků, ale i laboratoří zabývajících se účinky škodlivých látek vnějšího prostředí, šlechtitelských a zejména klinicky orientovaných laboratoří. oborcttoř ytokinetiky Mofyzikölnf úztov AVČA. IMNO • růstové signály l[[JZ^£JI protein gene transcription in proca ms 1(A) NEGATIVE REGULATION bound repressor protein prevents transcription LIGAND Ibinds to remove iregulatory PROTEIN FROM DNA bound repressor protein 4 ADDITION OF LIGAND SWITCHES GENE ON BY REMOVING REPRESSOR PROTEIN LIGAND Ibínds TO ALLOW IREGULATORY PROTEIN TO BIND TO PNA & GENE OFF LIGAND BINDS TO REMOVE REGULATORY PROTEIN FROM DNA GENE OFF REMOVAL OF LIGAND SWITCHES GENE ON BY REMOVING REPRESSOR PROTEIN inactive repressor |Figure 7-36 part 1 of 2. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition ÍB) POSITIVE REGULATION bound activator protein promotes transcription bound activator protein RNA polymerase GENE ONI mRNA ADDITION OF LIGAND SWITCHES GENE OFF BY REMOVING ACTIVATOR PROTEIN protein LIGAND BINDS TO ALLOW REGULATORY PROTEIN TO BIND TO DNA GENEON I mRNA > J 3' protein REMOVAL OF LIGAND SWITCHES GENE OFF BY REMOVING ACTIVATOR PROTEIN Figure 7-36 part 2 of 2. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. Co by mělo být rozhodováno nejdřív: KJaclš čsho se rozboč ačít a oroč? MFsramlilB] začít? Jaké máme možnosti uplatnění skončení studia? ytokinetiky Biofyzikálni ústav flVČR, ARNO