Morfologie – nekróza vs. apoptóza l ztráta integrity plazmatické membrány l bobtnání cytoplazmy a zvětšení buňky l rozbití jádra l desintegrace buněčných organel l kompletní lyze buňky l bobtnání cytoplazmatické membrány, integrita membrány není porušena l zmenšení velikosti buňky l kondenzace a specifická fragmentace jaderného chromatinu l udržení integrity intracelulárních organel l formace tzv. apoptotických bodies Biochemie – nekróza vs. apoptóza l Bez účasti specifických molekul l Pasívní proces bez dodání energie z ATP l Neregulovaná destrukce jaderné DNA l Není specifická role mitochondrií l Ztráta regulace iontových rovnováh l Aktivace specifických molekul l Nutné dodání energie ve formě ATP l Specifická fragmentace jaderné DNA l Uvolnění specifických regulátorů z mitochondrií l Změny symetrie membrán Fyziologický význam – nekróza vs. apoptóza l Postihuje skupiny buněk l Indukována nefyziologickými stimuly l Poškození okolní tkáně – vylití toxických látek l Spouští zánět l Týká se jednotlivých buněk l Indukována fyziologickými stimuly l Fagocytóza makrofágy l Není zánět Induktory buněčné smrti – nekróza vs. apoptóza l Hypoxie l Extrémní výkyvy teploty l Osmotický tlak l Silné změny pH l Lytické viry l Metabolické jedy l atd. l Nedostatek růstových faktorů l Hormonální změny l Specifické signály smrti - „death ligandy“ l Chemoterapie l UV-záření l Ztráta kontaktu s prostředím Význam apoptózy l Eliminace nepotřebných, poškozených, nebezpečných, mutovaných či jinak pozměněných buněk za účelem udržení homeostázy mnohobuněčného organismu Studium apoptózy v mnohobuněčném organismu l Caenorhabditis elegans (Nematoda) – první a velmi sofistikovaný model studia PCD Přesně řízený vývoj – organismus z 1090 buněk, z nich během vývoje 131 buněk umírá apoptózou – nutno přesné načasování a lokalizace, jinak vážné malformace Jeden z nejvíce studovaných organismů z hlediska popisu mechanismů apoptózy, podobnost s obratlovci (výskyt analogických apoptotických genů a proteinů) Apoptóza ve vývoji mnohobuněčného organismu l Metamorfóza hmyzu – vývoj imaga z larvy l Metamorfóza obojživelníků a plazů – ztráta ocasu pulců během proměny v žábu (postupná řízená indukce apoptózy a proměna tvaru těla) Apoptóza ve vývoji mnohobuněčného organismu l odumírání některých neuronů při vytváření CNS l formace tvaru orgánů a struktur – prsty a interdigitální prostory l odstranění abnormalit během embryogeneze (včetně spontánních abortů) Apoptóza v regulaci homeostázy organismu l Eliminace starých diferencovaných nepotřebných buněk (krevní, střevní, kožní…) l Eliminace již nepotřebných buněk mléčné žlázy po ukončení laktace l Regulace endometria během menstruačního cyklu l Odumření poškozených zárodečných buněk Apoptóza versus proliferace l Pro udržení homeostázy organismu je nutná dokonalá rovnováha mezi procesy proliferace a apoptózy l Porušení této rovnováhy má dalekosáhlé důsledky, které se odrazí na zdraví organismu l Obzvláště nutné pro intenzívné proliferující tkáně (krev, střevo…) Apoptóza a nemoci – zvýšená vs. snížená apoptóza l AIDS l Neurodegenerativní onemocnění (Alzheimer,Parkinson) l Myelodysplastický syndrom l Ischemické poškození (infakrt, reperfuze) l Intoxikace jater l Rakovina l Autoimunitní onemocnění l Virové infekce (Herpes, Adenovirus) Obecné rysy apoptózy l Změny na úrovni membrán l Změny na úrovni jádra l Účast specifických genů a proteinů v regulaci apoptózy Změny na úrovni membrán l Plazmatická membrána – Zachována integrita plazmatické membrány – Významné změny v symetrii membrány l Translokace fosfatidylserinu z vnitřní strany membrány na stranu vnější – signál pro fagocyty, které mají na povrchu specifické receptory pro PS Změny na úrovni membrán l Mitochondriální membrána – změny propustnosti vnější membrány mitochondrií, tvorba pórů v této membráně – významné změny mitochondriálního membránového potenciálu – umožnění vylití některých důležitých mediátorů apoptózy z mitochondrií do cytoplazmy Změny na úrovni jádra l Kondenzace a fragmentace jaderného chromatinu, shlukování jaderné hmoty v okolí jaderné membrány, charakteristická jaderná morfologie Změny na úrovni jádra l Specifická řízená degradace DNA – internukleozomální štěpení DNA - vznik charakteristických fragmentů DNA o délce 180 bp – účast specifických endonukleáz (Ca- a Mg- dependentních) Účast specifických genů a proteinů v regulaci apoptózy l Kaspázy l Inhibitory kaspáz l Nekaspázové proteázy l Proteiny rodiny Bcl-2 l Mediátory apoptózy uvolňované z mitochondrií Kaspáza-9 l iniciační kaspáza aktivovaná na úrovni signálního komplexu zvaného apoptozom l Složení apotozomu – cytochrom c, Apaf-1, prokaspáza-9, ATP l aktivace tzv. „vnitřní dráhy indukce apoptózy“ l prokaspáza-9 se štěpí na kaspázu-9, vznikají fragmenty o velikosti 35 a 17 kDa Efektorové kaspázy l Podílí se na exekuční fázi apoptózy l Specificky štěpí celou řadu důležitých substrátů v buňce l Kaspáza-3, -6, -7 Substráty kaspáz l Strukturální proteiny – laminy (jádro), aktin, fodrin (cytoskelet), keratin 18 (intermediární filamenta) l Signální a regulační proteiny – cPLA2, PKC, některé proteiny rodiny Bcl-2, MEKK-1 l Transkripční faktory – MDM2, RB l Proteiny v regulaci metabolismu DNA/RNA – PARP, CAD inhibitor (inaktivace DNázy závislá na kaspázách) Inhibitory kaspáz l FLIP - má sekvenci podobnou kaspáze-8, ale bez katalytického místa, kompetitivně inhibuje vazbu kaspázy-8 v DISCu l IAPs – „inhibitor of apoptosis proteins“ -cIAP1, cIAP2, XIAP, survivin – váží se na prokaspázy a kaspázy (prostřednictvím domény BIR) a blokují jejich aktivitu, mohou inhibovat jak iniciační, tak efektorové kaspázy – různé mechanismy Nekaspázové proteázy l Calpainy (I, II, calpastatin) l Cathepsiny (B, D, L) l Granzymy (A, B) l Mohou buď spolupracovat s kaspázami, nebo spouštět buněčnou smrt nezávisle na nich Calpainy l Cytosolové cysteinové proteázy l Aktivace závislá na vápníku (mM, mM), mají vazebné domény pro Ca2+, autolyze a autoaktivace l m-calpain (calpain I), m-calpain (calpain II), calpastatin (inhibitor calpainů) Cathepsiny l Lysosomální proteázy l Aktivovány v kyselém pH (lysosom) – autoproteolýza, nebo jinými proteázami l Nejznámější – cathepsin B, D l Během apoptózy translokovány z lysozomů do cytoplazmy – exekuce apoptózy Granzymy l Serinové proteázy T-buněk a NK-buněk l Spolu s perforinem se podílejí na indukci buněčné smrti (perforin vytvoří póry v buňce, umožní průnik granzymu B) l Granzym B se může účastnit aktivace kaspáz nebo DNáz Proteiny rodiny Bcl-2 l Důležité regulátory apoptózy na úrovni mitochondrií l Rodina asi 30 proteinů, pro něž je charakteristická přítomnost tzv. domény BH (Bcl-2 homology), které zprostředkovávají interakce s jejich vazebnými partnery l Patří sem proteiny jak s proapoptotickou, tak antiapoptotickou funkcí, na jejich rovnováze pak závisí osud buňky Bcl-2 l B-cell lymphoma 2 protein l Bcl-2 byl první popsaný člen této rodiny (po něm pojmenována) a zároveň první popsaný savčí regulátor apoptózy l Antiapoptotický protein l Obrovská úloha v rezistenci nádorových buněk k některým typům chemoterapeutik Mediátory apoptózy uvolňované z mitochondrií l Cytochrom c – aktivace kaspázy-9 na úrovni apoptozomu l Smac/DIABLO – inhibuje IAPs – přispívá tak k aktivaci kaspáz l endoG –mitochondriální nukleáza, translokuje se do jádra, kde štěpí DNA l Omi/Htra – serinová proteáza, antagonista některých IAPs l AIF – translokován do jádra, iniciace řady procesů apoptózy včetně např. kondenzace chromatinu Apoptóza zprostředkovaná přes povrchové receptory l Tzv. „death receptory“ – receptory smrti, přes ně dochází ke spuštění apoptózy indukované tzv. ligandy smrti l Patří do rodiny TNF (tumor necrosis factor) l Obsahují tzv. „death doménu“, která umožní pokračování přenosu apoptotického signálu (vazba s dalšími členy signální dráhy) Významné ligandy a receptory rodiny TNF l CD95L (FasL) – CD95, Fas l TNF-alfa – TNF-R1 l TRAIL – DR4, DR5, DcR1, DcR2, OPG Modelový systém pro studium apoptózy – in vivo l Epitel střeva, střevní krypta Modelový systém pro studium apoptózy – in vitro l Buněčná kultura na Petriho misce – adherentní epitheliální buňky kolonu l Postupné uvolňování původně přisedlých buněk do média, apoptóza, apoptotická tělíska l v umělé in vitro kultuře nejsou přítomny fagocyty, aby je pohltily, může proto docházet k tzv. sekundární nekróze Apoptóza vs. léčba rakoviny l Možnost spustit apoptózu nádorové buňky je základní podmínkou úspěšné protinádorové terapie l Řada nádorových buněk je však vůči apoptóze rezistentní l Je nutné objasnit mechanismy rezistence a překonat ji (nová léčiva, spuštění alternativních mechanismů, kombinovaná terapie, genová terapie…)