Imunizace Serologické reakce II pro studenty PřF hlavně pro obor Obecná biologie Ondřej Zahradníček Dnes máme na programu n Využití systému obranyschopnosti organismu k jeho umělému posílení – umělá imunizace (pasivní a aktivní) n Využití existence interakce antigen – protilátka v praktické mikrobiologické diagnostice (druhá část) `a praktika Základní rozdělení mechanismů obranyschopnosti organismu: opakování Hrad Imunštejn n 1 – vnější hradba (kůže) n 2 – vnitřní opevnění (hematoencefalická bariéra) n 3 – dubová brána (sliznice – slabší než hradby, ale pevná) n 4 – stoka (teoreticky možnost vniknout dovnitř, ale proud odpadní vody brání vniknutí) n 5 – obránci hradu (buněčná imunita) n 6 – vylévání horké vody přes hradby (vylévání produktů toxických pro útočníka, humorální imunita) Možnosti posílení jednotlivých složek imunity n Kůže, sliznice – celková péče o zdraví, nekouření (respirační sliznice) apod. n Funkční mechanismy: netlumení průjmu, u produktivního kašle léky podporující vykašlání a ne tlumící kašel (ty jsou vhodné tam, kde se nic nevykašle) n Prostředí nevyhovující mikrobům: prebiotické, probiotické a symbiotické preparáty (perorální, vaginální čípky aj.) Imunoterapie (léčení imunopreparáty) posílení imunity v užším slova smyslu Použití: prevence, profylaxe i léčení chorob n Imunizace – viz dále n Imunosuprese – potlačení imunitních reakcí – u nadměrné nebo špatné imunity n Imunostimulace – nespecifické povzbuzení nedostatečné imunity n Desenzibilizace – podávají se mikrodávky antigenu, aby si na ně organismus "zvykl" a nereagoval přehnaně; dávky se postupně zvyšují Imunizace - princip n Imunizace je založena na posílení specifické látkové, méně často i buněčné imunity n Hladovému muži na břehu řeky n nachytáme ryby – pasivní imunizace n pomůžeme, aby se naučil ryby chytat – aktivní imunizace n někdy kombinujeme obojí Pasivní imunizace n Do organismu jsou vneseny už hotové protilátky nebo sérum, které je obsahuje. n Nevýhoda: protilátky od cizího člověka nikdy nejsou stejné, fungují méně účinně a postupně se jich tělo zbavuje (krátkodobý účinek) n Výhoda: organismus je chráněn okamžitě. Nevýhodu krátkodobého účinku lze odstranit, pokud pasivní imunizaci zkombinujeme s pasivní (například u tetanu) Možnosti pasivní imunizace n Nespecifická séra n z krve mnoha dárců n obsahují protilátky proti mnoha běžným chorobám n obsahují i také řadu nežádoucích složek n proto se s jejich používáním čím dál více váhá. n Specifické protilátky – příklady n TEGA – proti tetanu n HEPAGA – proti hepatitidě B n BOSEA – globuliny proti botulismu n GASEA – proti plynaté sněti Aktivní imunizace n Aktivní imunizace = očkování: do organismu je vnesena očkovací látka, obsahující antigen. Tělo je antigenem "vyprovokováno" a vytváří protilátky. n Očkování proti TBC – výjimka: cílem zde není vyvolat tvorbu protilátek,ale tvorbu buněčné imunity, což souvisí se zvláštními mechanismy u TBC infekce Výroba očkovací látky Očkovací látky proti bakteriálním nákazám I n Očkování živými bakteriemi se používá u tuberkulózy. Očkování se provádí ihned po narození a nepřeočkovává se, jen se kontroluje stav imunity (tzv. tuberkulínovým testem). Bakterie je speciální vakcinační kmen, jiný druh, ale antigenně podobný TBC. n Bakteriny – celé usmrcené bakterie. Například očkování proti černému kašli, způsobenému Bordetella pertussis. Očkovací látky proti bakteriálním nákazám II n Anatoxiny neboli toxoidy – tam, kde bakterie škodí hlavně prostřednictvím toxinů (jedů). Anatoxin = jed zbavený jedovatosti (toxicity), který si zachovává antigenní působení. Např. očkování proti tetanu a záškrtu. n Čištěné povrchové antigeny (např. polysacharidové), např. Haemophilus influenzae b, Neisseria meningitidis aj. Očkovací látky proti virovým nákazám n Živé vakcíny – pěstují se oslabené kmeny virů na buněčných kulturách. U oslabených osob mohou vyvolat různé reakce. Spalničky, zarděnky, příušnice; na lžičce podávaná (IgA!!) – dětská obrna (Sabin). n Usmrcený virus. Virus je vypěstován a poté usmrcen, nejčastěji formaldehydem. Klíšťová encefalitida, žloutenka A n Chemovakcíny. Antigen byl získán „chemickou“ cestou (rekombinací DNA). Např. látka Engerix proti hepatitidě B. Druhy očkování n Základní očkování – dnes již deset očkování tzv. očkovacího kalendáře n Očkování mimo tento základ, např. n Očkování u profesionálního rizika (hepatitida B u zdravotníků, klíšťová encefalitida u lesníků) n Očkování před cestou (žlutá zimnice…) n Očkování pro oslabené (chřipka) n Očkování profylaktické (vzteklina) n Očkování na přání (chřipka, klíšťová e.) Očkování proti TBC n Očkuje se samostatně, momentálně první týden po narození (uvažuje se o změně) n Během dalších let se provádí tzv. tuberkulinová zkouška – kožní test buněčné imunity. Pokud je negativní, očkuje se znovu. Pozor, očkovat ty, kteří imunitu mají, by bylo nebezpečné n V devadesátých letech ve dvou krajích experimentálně pozastaveno. Pro velký nárůst počtu případů TBC rychle obnoveno a děti doočkovány Očkování proti TBC Očkování proti tetanu n Očkuje se v čtyřkombinaci, spolu se záškrtem, dávivým kašlem a hemofily n Několikrát se přeočkovává, nejprve proti celé kombinaci, pak už jen proti samotnému tetanu (po deseti letech) n Tetanus dnes není běžný, ale je natolik závažný, že očkování je stále namístě. Tetanická klostridia se i dnes vyskytují ve střevě zvířat, a tedy i v zemi, pokud by se neočkovalo, bylo by riziko velké Očkování proti záškrtu n Očkuje se v čtyřkombinaci, spolu s.tetanem a hemofily n Po základním očkování se několikrát přeočkovává n Záškrt je stále aktuální, zejména vzhledem k migraci z postsovětských republik, kde se difterie i pertuse stále občas vyskytují n U náš se oboje vyskytuje občasně Očkování proti „Hib“ n Jde o očkování proti Haemophilus influenzae, a to proti opouzdřeným kmenům s pouzderným typem b n Látka je čištěný polysacharid n Očkuje se v čtyřkombinaci, spolu se záškrtem, dávivým kašlem a tetanem n Bylo zavedeno před několika lety a po jeho zavedení významně poklesl počet invazivních hemofilových infekcí předškoláků (záněty mozkových blan, plic, příklopky hltanové) Očkování proti hepatitidě B n Očkuje se samostatně, ale zároveň s.předchozí čtyřkombinací (momentální stav, uvažuje se o změně). Je to chemovakcína n Další z poměrně nedávno zavedených očkování – i dříve ovšem používáno, ale jen u rizikových skupin (např. děti HBsAg pozitivních matek) či profesního rizika (zdravotníci) Očkování proti dětské obrně n Očkuje se samostatně, používá se perorální Sabinova vakcína – živý virus. Je velmi účinná, ale má riziko komplikací, i když jen nepatrné n Pravděpodobně se ale přejde na injekční Sabinovu vakcínu (usmrcený virus) a bude se očkovat v kombinaci s několika jinými vakcínami. n U nás se dětská obrna nevyskytuje, ale vyskytuje se v Asii i JV Evropě, takže cíl, kterým je celosvětová eradikace tohoto závažného onemocnění, je ještě daleko Salk a Sabin Očkování proti spalničkám n Očkuje se v trojici se zarděnkami a příušnicemi, ve všech třech případech jde o živé viry n U těchto očkování se nejčastěji objevují pochyby, jestli je nutné a vhodné n Ovšem spalničky jsou poměrně nepříjemné, pro dítě bolestivé onemocnění, a způsobují ekonomické ztráty (absence rodiče v práci) n Existuje i riziko sklerotizující spalničkové panencefalitidy (zánětu mozku), hlavně u dospělých. Je velmi vzácné, ale závažné. Očkování proti zarděnkám n Také zarděnky v době před očkováním znamenaly velké ekonomické ztráty, komplikace pro školy a školky apod. n Zarděnky jsou také nebezpečné u těhotných, kde existuje riziko potratu u infikovaných žen. n Proto byly v 80. letech očkovány nejprve dívky ve 12 letech a pak i všechny dvouleté děti Očkování proti příušnicím n Pro příušnice platí totéž co pro předchozí dvě choroby n Zatímco zarděnky byly nebezpečné těhotným dámám, příušnice hrozí spíše pánům (dospělým) – riziko zánětu varlat (orchitidy), vedoucí až k.neplodnosti Očkování „MMR“ (measles, mumps, rubella = spalničky, zarděnky, příušnice Očkování proti chřipce n V poslední době populárnější než dříve, vzhledem k riziku tzv. aviární chřipky (H5N1) n U chřipky je ovšem třeba počítat s.rizikem antigenního driftu (drobné změny antigenní struktury) a shiftu (větší antigenní posuny). Proto očkování nezanechává trvalou imunitu a musí se každý rok obnovovat Očkování proti chřipce Očkování proti klíšťové encefalitidě n Často žádané očkování – ovšem lidé většinou nechávají očkovat děti, ačkoli onemocnění probíhá závažněji u dospělých. Do 6 let se nedoporučuje. n Očkuje se dvěmi dávkami zpravidla v.zimním období, třetí („boosterová“) dávka následuje další zimu. Doporučuje se po třech letech přeočkovat n Nechrání samozřejmě proti borelióze Další očkování n proti meningokokové infekci n proti pneumokokové infekci n proti planým neštovicím (1) n proti různým tropickým chorobám n proti rakovině cervixu n proti HIV (výzkum) Úvodem k druhé části n Budeme pokračovat v diagnostice, založené na interakci antigenu (v.případě mikrobiálních antigenů jde o povrchovou část těla mikroba) s.protilátkou (imunoglobulinem, který je tvořen makroorganismem. n Přitom můžeme prokazovat zvířecí protilátkou antigen (přímý průkaz) nebo antigenem protilátku v séru (nepřímý průkaz) Průkaz antigenu a antigenní analýza (opakování) n V rámci průkazu antigenu (tedy přímého průkazu) lze ještě dále rozlišit dva podtypy: n Přímý průkaz antigenu ve vzorku, například ve vzorku mozkomíšního moku n Antigenní analýza (identifikace) kmene, izolovaného ze vzorku (například kmene meningokoka) n U nepřímého průkazu naopak vždy pracujeme se vzorkem, a to se vzorkem séra, kde hledáme protilátky A ještě trochu opakování: Interpretace n Průkaz antigenu (včetně antigenní analýzy) je přímá metoda. Pozitivní výsledek znamená přítomnost mikroba v.těle pacienta n Průkaz protilátek: je to nepřímá metoda. Nicméně jsou způsoby, jak alespoň odhadnout, kdy přibližně se mikrob s.tělem pacienta setkal: n Množství protilátek (relativní – jako titr) n Třída protilátek: IgM/Ig n Avidita protilátek – síla vazby na antigen Jak tyto informace zjistit n Akutní infekce: velké množství protilátek, převážně třídy IgM n Pacient po prodělané infekci: malá množství protilátek, hlavně IgG (imunologická paměť) n Chronická infekce: různé možnosti Opakování Pojem titr Proč nestačí samotný titr Někdy se stane, že málo reaktivní pacient má i v.akutní fázi titr dosti nízký Párová a nepárová séra n Párová séra = první vzorek je uchováván v ledničce, dokud nepřijde i druhý. Pak jsou oba hodnoceny naráz. 4násobný vzestup se v tom případě má za signifikantní pro akutní infekci. n Séra nejsou párová (druhý vzorek je vyšetřen zvlášť): zvětšuje se riziko náhodné, chyby, proto zpravidla vyžadujeme 8násobný vzestup titru Zapamatujte si: n Veškeré „srandičky“ typu titry, třídy protilátek, zjišťování avidity, slouží k odlišení akutní infekce, chronické infekce a stavu po dávno prodělané infekci. Týkají se pouze nepřímého průkazu! n Přímý průkaz totiž přímo prokazuje v těle pacienta část patogenova organismu. Není tedy nutné žádné další upřesnění Typy serologických reakcí a jejich způsoby využití Komplementfixace (KFR) n Komplement = jedna ze složek imunitní reakce n Pro KFR používáme morčecí komplement. Pacientův komplement je před reakcí inaktivován n Komplement není schopen vázat se na samotný antigen n Komplement není schopen vázat se na samotnou protilátku n Komplement je schopen vázat se pouze na KOMPLEX obou Princip komplementfixace n Komplement se tedy váže na komplex antigen-protilátka. To ale samo o sobě není vidět. n Proto používáme ještě tzv. indikátorový komplex – beraní erytrocyty + králičí protilátky proti nim. V případě, že se na tento komplex naváže komplement, dojde k hemolýze Pokus k ověření funkce komplementu Amboceptor = králičí protilátka proti beraním erytrocytům n Beraní ery + amboceptor bez komplementu `a není hemolýza n Beraní ery + komplement bez amboceptoru `a není hemolýza n Beraní ery + komplement + amboceptor `a hemolýza n Králičí ery + komplement + amboceptor `a není hemolýza Princip KFR (negativní, pozitivní) Problémy s KFR n Příliš mnoho komplementu `a falešná negativita. Co dělat? Titrovat komplement (viz další obrazovka) n Některá složka séra sama o sobě vyvazuje komplement (složka antikomplementarity): falešně pozitivní výsledky. Co dělat? Provést test antikomplementarity. Je to vlastně „skoro normálně“ provedená reakce, ovšem bez antigenu Titrace komplementu n Pro reakci potřebujeme množství morčecího komplementu, které není moc velké ani malé. n Proto zjišťujeme, jaké množství komplementu hemolyzuje pracovní jednotku krvinek s.amboceptorem (hemolytická jednotka) Test antikomplementarity Použití KFR n KFR lze použít pro diagnostiku mnoha, zejména virových infekcí n Jako i jiné serologické reakce se KFR používá k průkazu antigenu či protilátky n Častější je ale průkaz protilátky, proto se jím budeme zabývat víc n Berme to tedy tak, že máme laboratorní antigen, který konfrontujeme se sérem pacienta (kde hledáme protilátky) Neutralizační reakce: obecný princip n Protilátky fungují několika způsoby. Jeden z nich je přímá neutralizace. n Tento způsob se zřídka vidí u celých bakterií. Pozorujeme ho u virů nebo bakteriálních toxinů Nicméně někdy protilátky neutralizují i určitou charakteristiku celé bakterie, např. pohyblivost Treponema pallidum u tzv. Nelsonova testu (TPIT). Neutralizace schématicky n Protilátka (Ig) brání efektu toxinu/viru na buňku / krvinku n Příklad: ASLO (Toxin = streptolyzin O, Ig = antistreptolyzin O, krvinka) Příklady neutralizačních reakcí Příklad 1: ASLO n Protilátka blokuje hemolytický efekt toxinu (streptolyzinu O) na krvinku. n ASLO není nepřímý průkaz, přestože hledáme protilátky. Nepátráme tu po patogenovi, určujeme samotné protilátky, jež mohou být nebezpečné n U ASLO neužíváme geometrickou řadu. Hodnoty ředění jsou speciální. n Titr nad cca 250 znamená možnost autoimunitní odpovědi Proč se dělá ASLO n Pomocí testu ASLO zjistíte, zda je přítomna normální protilátková odpověď, nebo přemrštěná automimunita s rizikem vývoje glomerulonefritidy nebo revmatické horečky n Test ASLO se provádí zpravidla po prodělané streptokokové infekci. Průkazem protilátky se nesnažíme prokázat infekci (o té víme), ale zjistit, zda dochází k vývoji autoimunity. Nejde tedy vlastně o nepřímý průkaz, přestože prokazujeme protilátky. ASLO: princip Hodnocení ASLO n Panel se odečítá naležato. Obsahuje pozitivní kontrolu a sedm pacientů. Příklad 2: HIT n Hemaglutinačně Inhibiční Test n Pozor, tohle NENÍ aglutinace, je to druh neutralizace! n Protilátka neutralizuje virové shlukování krvinek (in vitro vlastnost většiny virů) n Úkol: Odečtěte výsledky HIT u klíšťové encefalitidy. Učiňte pravděpodobný závěr (akutní infekce? Pouze paměťové protilátky? a podobně) n V prvním sloupci ředění 1 : 10 Úkol 3: VNT (nepleťte si to s TNT J ) n Virus Neutralizační Test n Buněčná kultura bývá poškozena virem. Škodu můžeme pozorovat jako změnu barvy v důlku (pH se mění) n Jsou-li přítomny protilátky, mohou tomuto vlivu na buňky zabránit Průběh protilátkové odpovědi z hlediska tříd Ig n Protilátky IgM se tvoří jako první, ale také jako první mizí. Neprocházejí placentou, jejich průkaz u novorozence je svědectvím jeho infekce n Protilátky IgG se tvoří později a zůstávají jako paměťové přítomny dlouhodobě. Procházejí placentou Protilátky ostatních tříd n Protilátky třídy IgA se u některých infekcí vyšetřují místo protilátek IgM. Tato třída se uplatňuje hlavně u slizniční imunity, a tedy u infekcí, kde branou vstupu je sliznice (například gastrointestinální) n Protilátky třídy IgE se vyskytují u alergií. Zpravidla se však nestanovují specifické IgE proti nějakému patogenovi n S protilátkami IgD se v mikrobiologii nepracuje Reakce se značenými složkami n Na povrch se postupně navazují jednotlivé složky n Místo jedné ze složek se pokusíme navázat vzorek od pacienta, o kterém si myslíme, že danou složku možná obsahuje n Je-li to pravda, složka se naváže n Pokud se všechny složky postupně navážou, vznikne nepřerušený řetězec n Na konci řetězce je vhodné značidlo Promytí a jeho význam n Pokud by v reakci zůstalo přítomno i to, co se na nic nenavázalo, nedokázali bychom odlišit pozitivní reakci od negativní n Proto po každém kroku reakce následuje promytí, po kterém zůstanou přítomny pouze složky navázané na pevný povrch n Je-li řetězec přerušen, odplaví promytí vše za místem přerušení Průběh pozitivní reakce (možnost se třemi složkami – mohou být jen dvě) Průběh negativní reakce (možnost se třemi složkami) Typy značidel n Fluorescenční barvivo je značidlem u imunofluorescence n Radioizotop je značidlem u reakce RIA n Enzym je značidlem u reakce ELISA n Western blotting je zvláštním případem reakce ELISA, kde jednotlivé antigeny jsou elektroforeticky rozděleny Používáme-li jako značidlo enzym, je poslední složkou přidanou do reakce ještě příslušný substrát – tedy jeden krok navíc. Možnosti uspořádání složek modře vždy složka pocházející ze vzorku získaného od pacienta n Povrch-antigen-protilátka-značidlo (P) n Povrch-protilátka-antigen-protilátka-značidlo (P, např. průkaz HBsAg) n Povrch-antigen-protilátka-antigen-značidlo (N) n Povrch-antigen-protilátka-konjugát-značidlo (N) Konjugát je protilátka namířená proti lidské protilátce Význam konjugátu n Konjugát se používá zpravidla u reakcí nepřímého průkazu (průkaz protilátek) n Je to protilátka, pro kterou je antigenem lidská protilátka např. IgM nebo IgG n Dokáže být selektivní proti určité třídě lidské protilátky n Použití konjugátu je tedy podstatou možnosti selektivního průkazu jednotlivých tříd protilátek Příklad reakce ELISA použité k detekci protilátky Přímá a nepřímá imunofluorescence vypadají stejně Přímá imunofluorescence n (Povrch)-(antigen)-(značená protilátka) Nepřímá imunofluorescence n (Povrch)-(antigen)-(protilátka)-(značená protilátka proti lidské protilátce) ELISA – proč je tak oblíbená n U reakce ELISA je na konci celého procesu enzymatická reakce. Její intenzita se projeví jednoduše: intenzitou zbarvení v.důlku, kde reakce probíhá. Sytá barva = vysoce pozitivní. n Nenáročnost z hlediska nákladů a nulové radiační nebezpečí je výhodou oproti radioimunoassayím n Možnost automatizace je velkou výhodou oproti imunofluorescenci ELISA – praktické provedení n Zpravidla máme k dispozici destičku s.jamkami. Na rozdíl od klasických serologických reakcí má každý pacient nikoli celý řádek, ale jen jeden důlek. To proto, že nezjišťujeme titry n Před vlastními důlky pacientů bývá: n Bl – blank (pro kalibraci spektrofotometru) n K- a K+ – pozitivní a negativní kontrola n Cut off (dva či tři důlky) – výrobcem dodané „vzorky“ s právě hraniční hodnotou absorbance („odsekávají“ pozitiv. výsledky) ELISA – ukázka (www.medmicro.info) Western blotting n Název – slovní hříčka (badatel Southern) n Prakticky je to ELISA, ale směs antigenů je rozdělena elektroforeticky na jednotlivé antigenní determinanty n Je tedy přesnější a pomáhá zejména tam, kde klasická ELISA troskotá na zkřížené pozitivitě např. příbuzných mikroorganismů Western blot – vzhled (obrázek z www.medmicro.info) Pro dnešek děkuji za pozornost