Základy genomiky genomiky Jan Hejátko ^ Masarykova univerzita, Laboratoř funkční genomiky a proteomi Laboratoř molekulární fyziologie rostlin j MASARYK UNIVERSITY Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Základy genomiky IV. Zdrojová literatura ke kapitole IV: Plant Functional Genomics, ed. Erich Grotewold, 2003, Humana Press, Totowa, New Jersey Surpin, M. and Raikhel, N. (2004) Traffic jams affect plant development and signal transduction. Nature Reviews/Molecular Cell Biology 5,100-109 Zouhar, J., Hicks, G.R. and Raikhel, N.V. (2004) Sorting inhibitors (Sortins): Chemical compounds to study vacuolar sorting in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., 101, 9497-9501 MASARYK UNIVERSITY Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. Metody identifikace funkce genů pomocí přístupů získané funkce T-DNA aktivační mutageneze ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese Fenotypové profilování DNA a proteinové čipy metabolické profilování metody mikrodisekce Metody využívané ve funkční genomice rostlin A. thaliana jako modelový organizmus funkční genomiky rostlin příprava transgenních rostlin Southern blot a DNA molekulární hybridizace izolace genomové DNA, PCR MASARYK UNIVERSITY Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. Metody identifikace genů pomocí přístupů získané funkce T-DNA aktivační mutageneze metoda umožňující izolaci dominantních mutantů prostřednictvím náhodné inzerce konstitutivního promotoru, vedoucí k nadměrné expresi genu a tím odpovídajícím fenotypovým změnám prvním krokem je příprava mutantní knihovny připravené pomocí transformace silného konstitutivního promotoru nebo zesilovače následuje vyhledávání zajímavých fenotypu identifikace zasaženého genu např.pomocí plasmid-rescue »f*Mo;«. MASARYK UNIVERSITY Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Isolation of the CK77 gene Tatsuo Kakimoto, Science 274 (1996), 982-985 izolace genu pomocí aktivační mutageneze - mutantni fenotyp je fenokopii exogénni aplikace cytokininů (CKI1, CYTOKININ INDEPENDENT Plasmid ^2 rescue 35S\:CK1 cDNA t-zeatin no hormones /ý-a; x é.-rrc ^ E ; E - z^5^ . A ."•> \ Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genor Metody identifikace genů porno T-DNA aktivační mutageneze ektopická exprese a syst« exprese Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. Systémy regulovatelné genové exprese umožňují časovou nebo místně specifickou regulaci genové exprese, vedoucí ke změně fenotypu a tím identifikaci přirozené funkce genu ■ pOP systém 1 UAS systém *?y --S3* MASARYK UNIVERSITY Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. systémy regulovatelné exprese, pOP 35S LhG4 activator x reporter TATA CKM reporter ■m-:\ Genomika IV. systémy regulovatelné exprese, pOP +DEX 35S LhGR activator x reporter •PSI TATA= CKM reporter ■m-:\ Genomika IV. systémy regulovatelné exprese +DEX 35S activator x reporter wt Col-0 TATA reporter pOP «AI TATA pOP CKI1 GUS Genomika IV. systémy regulovatelné exprese, UAS http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/ MASARYK UNIVERSITY Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. Metody identifikace genů pomocí přístupů získané funkce T-DNA aktivační mutageneze ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese Fenotypové profilování DNA a proteinové čipy MASARYK UNIVERSITY Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. Fenotypové profilování DNA a proteinové čipy metoda umožňující rychlé porovnání velkého množství genů/proteinů mezi testovaným vzorkem a kontrolou nejčastěji jsou používané oligo DNA čipy i ■ ■ i - - Affymetrix,ATHJ Arabidoosis genom Jpozici komerčne aostupne saay pro cely genom enome array ..ia Operor [abidopsis t možnost pol syntézy oligo touto technik» Critical Specification Number oF arrays One Number oF aaquanca rapraaanted jr24jO0O gene sequences Feature &ize ISum üligonuclüotidoprorx? length 2&-mar Probo pa i rs,'soquence 11 Control aaquancaa £". c&tf ganaa bioB, bioC, bioD. B. subtitis gene iysA. Fhaga PI era gana. Arabidopaia maintenance ganaa GAPDhL Ubiquitin, and Actin Detection sensitivity 1:100.000^ * As measured by detection In comparative analysis detwaen a complex target containing spiked 1 control transcriptions and a complex target with no spi kas. in pro analýzu exprese, ale např. i genotypování pfllymorfizmy, sekvenování pomoci čipu, ...) im m MASARYK UNIVERSITY Genomika IV. DNA čipy DNA čipy, analýza výsledků pro správnou interpretaci výsledků je nutná dobrá znalost pokročilých statistických metod je nutné zahrnout dostatečný počet kontrol i opakování kontrola na přesnost měření (opakované měření na několika čipech se stejným vzorkem, vynesení stejných vzorků analyzovaných na různých čipech proti sobě) kontrola reproducibility měření (opakované měření s různými vzorky, izolovanými za stejných podmínek na stejném čipu-stejné podmínky proti sobě) identifikace hranice spolehlivého měření konečně vynesení experimentu proti kontrole nebo různých podmínek proti sobě - vlastní výsledek Expression of 195M6T7 in response to chemical treatment Stair Home | About TAIR | Silemap | Contact | Help | Order | Login Search | Tools | A rabid ú pais Info | Now» | Links | FTP | Stotkfi ~|Gene Experiment: Aluminum Stress Experiment \ Summary______Samples ▼| Search Slides & \ Array Datasets \_Desiyn______ View All \ Slide Details 7304 CV3.7305 Cv5 7304 CV5.7305 Cv3 7304 Cy5.7305 Cv3 *má^m*mfr&f& v současnosti je již velké množství výsledků různých experimentů lokalizovaných ve veřejně přístupných databázích Genomika IV. proteinové čipy Proteinové čipy čipy s vysokou denzitou obsahující řádově 104 proteinů analýza protein-proteinových interakcí, substrátů kináz a interakcí s malými molekulami možnost použít protilátky - stabilnější než samotné proteiny *?y --S3* MASARYK UNIVERSITY Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. proteinové čipy Identifikace proteinů interagujících s cytoplasmatickou částí integrinu aMbß3 krevních destiček exprese cytoplasmatické části jako fúzního peptidu biotin-KVGFFKR analýza vazby s proteinovým čipem obsahujícím 37.000 klonů E.coli exprimujících lidské rekombinantní proteiny potvrzení interakce pull-down analýzou peptidů i koprecipitací celých proteinů (chloridový kanál ICIn) další využití např. při identifikaci substrátů kináz, kdy substráty jsou navázány na čip a vystaveny působení kináz za přítomnosti radiokativně značeného ATP (768 purif. proteinů ječmene, z nich 21 identifikováno jako subtráty kinázy CK2a, Kramer et al., 2004) ■ . -, ms •■ ■ I |-iirt:..hn'M i ^ä — ■'■■ -u .; :{b} Peptide synthesis: -KVGFFKR -KAAAAAR oontrol KVGFFKR peptide KAAAAAR oontrol Screening of 37 ODO human expression clones (hEx1 library) reveals binding of KVGFFKR peptide to 19 clones -including two coding for a chloride channel. Integrin probe CI channel probe Peptide pulldown assa. Integrin probe Co-precipitation of chloride Channel and integrin ctMb|i3 from platelet lysáte^ -in vivo co-localization -Surface plasmon resonance Chjg D's cover/ Today MASARYK UNIVERSITY 83 Genomika IV. Metody identifikace genů pomocí přístupů získané funkce T-DNA aktivační mutageneze ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese Fenotypové profilování DNA a proteinové čipy metabolické profilování metody mikrodisekce proteomické přístupy Metody využívané ve funkční genomice rostlin A. thaliana jako modelový organizmus funkční genomiky rostlin příprava transgenních rostlin Southern blot a DNA molekulární hybridizace izolace genomové DNA, PCR MASARYK UNIVERSITY Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Arabidopsis thaliana huseníček polní, mouse-ear cress malé nároky na kultivační plochu velké množství semen (20.000/rostlinu a více) malý a kompaktní genom, (125 MBp, cca 25.000 genů, prům. velikost 3 kb) 5 chromozomů vhodná pro široké spektrum fyziologických experimentů velká přirozená variabilita (cca 750 ekotypů (Nottingham Arabidopsis Seed Stock Centre)) ^T li 1 . . jM f^m r , !Í Columbia 0 Landsberg 0 Wassilewskija 0 MASARYK UNIVERSITY http://seeds.nottingham.ac.uk/ Arabidopsis, významný rostlinný model Počet záznamů v databázi „PubMed" (MEDLINE) vyhledaných pod heslem „Arabidopsis" 12.389. (Pro srovnání, pod heslem „human" nalezeno 493260 záznamů). Arabidopsis Publications Numbs r of Publications 600 400 200 ttt I IA4I I Thr^ 2» ------ 3w| 162 «- 42 M 1 1985 1986 15B7 1MB T3ÍÍ9 1390 1331 13»? IB5*ä isy4 YfiSr Entrez records Database name Direct links Protein Structure Genome Popset SNP 3D Domains GEO Datasets GEO Expressi UniGene UniSTS PubMed Centr al Gene Taxonomy 618.539 118.482 61.406 25.447 rawssT r.'iiiF:;iiii:if:- MASARYK UNIVERSIT National Science Foundation, USA,", http://www.nsf.gov/bio/pubs/arabid/chaplhtm TAIR, http://www.arabidopsis.org/info/aboutarabidopsis.jsp Transformace Arabidopsis prostřednictvím Agrobacteria tumefaciens Crown gall of raspberry caused by Agrobacterium tumefáciens. Transformace Arabidopsis prostřednictvím Agrobacteria tumefaciens přenos bakteriální DNA do rostlinné buňky BamH I 399 Hind III 1345 ^Piam cell Agrobacterium mediated plant transformaKon hol Hne II pal Sph I 2328 ac II 3198 Eco RI 927& Pst I 9240' Nde I 9068' Apa I 4488 Not I 4898 Kpn 16918 Xho I 69081 Nde I 5468 Cla I 5598 Transformace kokultivací listových disků tabnb/j. . I —n-rl AriHUli H Viů rji "*_ ■ 4 Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Transformace kokultivací kalusů Control BAP ■ Ol Je Im lo l< Id)| Je ■cm l^k J Trans-zeatin Dexamethasone INI:» MASARYK UNIVERSITY Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Transformace „nastřelováním" DNA ■•.' t Statistic delivery of DNA accolflFBhoo lubo Ruuturi *sl( i^lfcitC MASARYK UNIVERSITY Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky ■ k Transformace květenství ......_.........._ PlHriťtránstonmůd séacflíngs Íri soiL i raaib-ioíi^G ímí^s^ ŕirt aruan ans ne^a i it* leavöä on sůíiůciwo http://www.bch.msu.edu/pamgreen/green.htm **V--S3* MASARYK UNIVERSITY Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Rychlá izolace genomové DNA Homogenizujte rostliny skleněnou tyčinkou v 1.5 ml zkumavce („eppendorfka") v tekutém dusíku. Použijete jeden až dva středně velké listy Přidejte 400 jlxI extrakčního pufru, vortexujte 5 s a nechte stát při pokojové teplotě. lýza buněčné stěny Stočte na stolní odstředivce Eppendorf při 15000 otáčkách po dobu 30 min, 4 °C. odstranění zbytků buněčné stěny a nelyžovaných pletiv Přeneste 300 [}\ supernatantu do nové zkumavky a přidejte 300 jíl izopropanolu. Nechte stát 15 min. srážení genomové DNA Odstřeďujte jako v bodě 3. DNA vysrážena izopropanolem bude v peletu. Promyjte pelet 500 pl 70% etanolu. Nechte vysušit (SpeedVac,!«*^ cca 15 min). vymyti soli Pelet rozpustíme v 50 jlxI vody. MASARYK UW/ERGÍtY Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky ARR4 AHP4 ARR21 ATG PCR dli lönew IM Am-N©tuFJySpBm All Database, Pu£>Med ed A ílrví :2 ?f the Nráíssl 1 ibraiy of Ms divine and lbe National institutes oť Redťb [Sign lni TRec Mudeqtida , ,, Protein Structure v QMIMV t PMC Search j P^uMed ^j for jcnemical genetics ^siiiiimNivsiN.____- Limits chemická gen« jo cnemickei tfieYfáth („př iBBETMkáy^ s .SBÄrznľ che Tutorial New/Npteworthy atitip*nto uceler of 1844 Next ôtígEšňkfo j Display ;^,jrí,™irV r— All: 36880 j Review; 4001 ma eher——----- Items 1 - 20 of 36880 interakce protein j~~ | - Lafochcllc S. Ballmer J, Gamble VIJ, Barboza NM Krtiyhill Bt\ Related Articles Links ^ evhi-n; JO. MxvFt KM. ľisher KP. BDichotomous but stringent substrate selection by the dual-function Cdk7 ccmplc; fever-í rd by chcnr-al poetics. Nat Struct Mol Biol. 2005 Dec A: [lipub ahead of print] PMJL): Ifv>;í71l'J ) [í'h^.Vec - iľ supp icd by puu-k:hcr_ SiogJe .Citation Matche; BíttktaáaónaBiaAyz Clinical Queries Special Queries LinkOut My NCBl r 2: Li J\ Palceck SP. Related Articles. Links I Jeritificatiott of Csndkfo albicans Genes tha* Induce S^ccharomyces ccrcvisiae Cell Adhesion and Morphogenesis. IVERSITY Related Articles. Genomika IV. chemická genetika Analýza mechanismů endomembranoveho transportu přístupy chemické genetiky v rostlinných buňkách dochází k velice dynamickým procesům, zprostředkovávaným zejména tzv. endomembranovým transportem (viz film, GFP směřované do ER) endomembranový transport je důležitým regulačním mechanismem při přenosu signálu a regulaci buněčných procesů Genomika IV. chemická genetika Analýza mechanismů endomembranoveho transportu přístupy chemické genetiky pomocí vyhledávání v „knihovně" chemických látek byly identifikovány takové, které vedou u kvasinek (S. cerevisiae) k sekreci enzymu (karboxipeptidázy Y), která je normálně transportována pomocí endomembranoveho transprtu do vakuoly analýza změny sekrece pomocí dot-blotu a imunodetekce karboxipeptidázy Y v kultivačním médiu pomocí monoklonálních protilátek identifikované látky („sortiny") byly schopny vyvolat obdobné změny i u /4rab/'c/ops/s_(konzervované mechanismy transportu u kvasinek i u rostlin) pro bližší identifikaci molekulárního procesu ovlivněného jedním z identifikovaných „sortinů" byla provedena analýza jeho vlivu na sekreci markerového proteinu (AtCPY) - sortin 1 inhibuje specificky pouze tuto sekreční cestu pomocí EMS mutageneze identifikace mutantů se změněnou citlivostí k sortinu 1 (hyper- nebo hypo-senzitivní mutanti) fí Zouhar et al., 2004 MASARYK UNIVERSITY Genomika IV. chemická genetika Analýza mechanismů endomembránového transportu pomocí chemické genetiky - shrnutí GFP::d-TIP značení mebrány vakuoly (tonoplastu) a identifikace mutací vedoucí ke změně morfologie tonoplastu chemická genetika v kombinaci s klasickou genetikou -identifikace proteinů zúčastňujících se regulace endomembránového transportu proteomické přístupy - identifikace a analýza proteomu vakuol fa) Mutagenesis of labeled endomembrane lines Wildtype (b) Chemical genomics AtCPY f c) P roteo m ics of p u rif ied co m pa rtm e nts Purified vacuoles + mw Wt 1-DSDSPAGE Cut gel into slices u and digest Mano-LC MS.TvlS . ... I 11 ^^^É^i 20D 40O SBD BOO IHK- ÍZOD 14D0 Cunent Opinion in Planl Biology Genomika IV. Shrnutí Metody identifikace funkce genů pomocí přístupů získané funkce T-DNA aktivační mutageneze ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese Fenotypové profilování DNA a proteinové čipy metabolické profilování metody mikrodisekce Metody využívané ve funkční genomice rostlin A. thaliana jako modelový organizmus funkční genomiky rostlin příprava transgenních rostlin Southern blot a DNA molekulární hybridizace izolace genomové DNA, PCR MASARYK UNIVERSITY Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky