Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii

Anotace

Předmět je zaměřen na získání teoretických znalostí a praktických zkušenosí s moderními spektroskopickými metodami analýzy struktury a vzájemné interakce nukleových kyselin a proteinů. Z metodických přístupů bude zvláštní důraz kladen na vysoce citlivé fluorimetrické metody a jejich praktické použití v laboratorní praxi. Součástí výuky je blok navazujících praktických cvičení, což umožní experimentální ověření získaných teoretických poznatků za použití moderního laboratorního vybavení.

Přednášky 

  1. Základní přehled biofyzikálních metod používaných v biologii
  2. Definice a charakteristiky absorbce, fluorescence a fosforescence
  3. Přístrojové vybavení pro měření - spektrofotometr, spektrofluorometr 
  4. Časově ustálená fluorescence (Steady state)
  5. Časově rozlišená fluorescence (Time-resolved) 
  6. Anizotropie fluorescence a její změna při interakci makromolekul 
  7. Absorbční spektroskopie v biologické analýze molekul 
  8. Zhášení fluorescence, fluorescenční rezonanční přenos energie - použití při sledování strukturních změn molekul 
  9. Vlastní fluorescence biologicky významných molekul 
  10. Nevlastní fluorescence - fluorescenční značky, sondy a indikátory 
  11. Fluorescenční značení DNA a proteinů 
  12. Fluorescenční mikroskopie 
  13. Analytické použití fluorescence pro stanovení koncentrace 
  14. Příklady využití fluorescence v biologické praxi

Praktické úlohyProtein_laser

  1. Měření spektrálních charakteristik proteinů a nukleových kyselin
  2. Přesné stanovení koncentrace nukleových kyselin a proteinů za použití fluorescence a absorbční spektroskopie
  3. Vliv pH a teploty na spektrální vlastnosti fluorescenčních sond
  4. Měření vlastní fluorescence BSA, tryptofanu a tyroxinu
  5. Příprava fluorescenčně značeného fragmentu DNA
  6. Spektroskopická charakteristika fluorescenčně značené DNA
  7. Vizualizace makromolekul při elektroforetické separaci
  8. Využití fluorescenčního rezonančního přenosu energie (FRET) při sledování hybridizace komplementárních řetězců nukleových kyselin
  9. Sledování zhášení fluorescence po relaxaci vlásenkové struktury fluorescenčně značené DNA
  10. Real-time PCR - detekce amplifikace DNA
  11. Fluorescenční mikroskopie (fluorescenční in situ hybridizace)
  12. Studium vazby molekul za pomocí anizotropie fluorescence – vazba proteinu a fluorescenčně značené DNA