Reparace DNA DNA damage • Genom všech organismů je každodenně poškozován mnoha faktory vnějšího prostředí a produkty vlastního metabolismu. V lidské buňce vzniká v důsledku toho denně asi 100 000 poškození DNA • endogenní procesy • exogenní procesy Modifikace DNA po účinku mutagenů Četnosti poškození DNA v jedné buňce za den • 50 000 jednořetězcových zlomů DNA • 10 000 depurinací • 600 deaminací • 2000 oxidační lézí • 5000 alkylací • 10 dvouřetězcových zlomů Mutageny a mutace • Primární změny molekuly DNA vznikající důsledkem působení endogenních i exogenních faktorů (mutagenů) ještě nemusí vést ke vzniku mutací – pouze I. etapa !!! • Reparační mechanismy mohou realizaci mutace zabránit, event. vznik mutace stimulovat !!! • Prof Kondo 1969 – model molekulárního vzniku mutací – mutace jsou důsledkem chyb při reparaci Vznik indukovaných mutací je několikastupňový proces !!! • proniknutí mutagenu do buňky B) zásah jádra, vznik modifikací DNA Molekulární mechanismus vzniku mutací Reparace DNA - souhrn Poškození a reparace DNA – přehled mechanismů Reparace DNA • monoezymatické systémy (např. fotoreaktivace) • polyenzymatické systémy (např. excizní reparace) • konstitutivní mechanismy • inducibilní mechanismy • error-free (bezchybná reparace) • error-prone (mutagenní reparace) Reverze poškození DNA Enzymatická fotoreaktivace (1940 – Albert Kelner – Streptomyces griseus) Reparace O^6- alkylguaninu Adaptivní odpověď vůči působení alkylačních látek (1970 John Cairns) Nízká dávka Činnost O^6-metylguanin-DNA-metyltransfázy u E. coli (ada protein) Reparace jednořetězcových zlomů v DNA Reparace AP míst inzercí purínů Excizní reparace – vyštěpení poškození • bázová excizní oprava (base excision repair BER) - vyštěpení modifikované báze (např. modifikované báze, oxidativní poškození, AP místa, jednořetězcové zlomy) • nukleotidová excizní oprava (nukleotide excision repair NER) – vyštěpení až 30 nukleotidů (CPD, křížové vazby) • mismatch repair Bázová excizní reparace (BER) Bázová excizní reparace: (v každé buňce těla asi 20 000 x denně) • Rozpoznání poškození DNA specifickou glykozylázou – vznik AP míst • Napadení AP místa 5´specifickou AP endonukleázou – zlom s 5´fosfátovým koncovým zbytkem • 5´fosfátový koncový zbytek je vyštěpen DNA-deoxyribofosfodiesterázou (dRpáza) • Výsledná jednonukleotidová mezera se zaplní opravnou syntézou, která je dokončena DNA-ligázou Typy DNA glykozyláz Oxidativní poškození DNA Bázová excizní reparace - příklad Opravná (reparační) syntéza DNA – včleňování nukleotidů do DNA mimo S fázi – důkaz reparace DNA Short patch BER: excize 1 nukleotidu Long patch BER: excize 2-6 nukleotidů Nukleotidová excizní reparace (NER) Typy nukleotidové excizní opravy • globální genomová oprava (pomalejší, eliminuje poškození ze všech částí genomu) • transkribčně vázaná oprava (rychlá, oprava aktivně transkribovaných genů – léze v DNA bránící transkribci RNA polymerázou II) PREFERENČNÍ REPARACE !!! Globální genomová oprava a transkribčně vázaná oprava Preferenční reparace – rychlejší odstraňování CPD z přepisovaného řetězce DNA Mismatch array-oprava chybně zařazené báze Mismatch repair – proteiny mutS, mutH a mutL (E. coli) Mismatch reparace – odstraňuje nejen chybné báze ale i inzerce a delece Mismatch reparace • Mutace v genech MSH2 a MLH1 u člověka - častá u HNPCC – „hereditary non-polyposis colorectal cancer !!! • predispozice k nádorům střev Tolerance poškození DNA • přítomnost CPD v DNA – dočasná blokáda replikace – replikace pokračuje – vznik mezer v dceřiném retězci • DNA léze nejsou odstraněny – jde o toleranci poškození v matricovém retězci - opravuje se důsledek poškození • oprava mezer v dceřinném řetězci – postreplikační reparace (vyžaduje homologní sesterskou chromatidu) • transléze poškození – SOS reparace Postreplikační reparace – význam recA proteinu Postreplikační reparace Oprava mezer v dceřinném řetězci DNA- rekombinační reparace Reparace dvouřetězcových zlomů v DNA • dvouřetězcové zlomy – exogenní vlivy (záření) nebo endogenní (tvorba T-buněčných receptorů nebo immunoglobulínových genů) • rekombinační oprava • homologická rekombinace (HR) – poškozený úsek DNA získá genetickou informaci z nepoškozeného homologu (např. sesterská chromatida nebo z homologického chromozomu: error-prone - možnost vzniku duplikace, delece, translokace) 2. nehomologická oprava tzv. „end-joining“, jde o spojeni dvou DSB bez výrazné potřeby sekvenční homologie mezi konci DNA (NHEJ) – převládá v savčích buňkách Reparace dvouřetězcových zlomů DNA nehomologní opravou (G[1] fáze) Reparace dvouřetězcových zlomů DNA homologní rekombinace (G[2] fáze) Reparace křížových vazeb – FANC proteiny Syntéza DNA přes poškození • důležitý buněčný mechanismus, který umožňuje překonat blok v replikaci způsobený poškozením DNA • inducibilní typ opravy DNA, kterým se buňky vyhýbají letálnímu účinku některých poškození • error-prone reparace !!! SOS reparace (koordinovaná syntéza enzymů a činnost reparačních mechanismů indukovaná poškozením DNA) SOS reparace Inducibilní reparace Klastogenní adaptace indukovaná nízkými dávkami ionizujícího záření - aberace (Vicia faba) Klastogenní adaptace indukovaná nízkými dávkami ionizujícího záření - mikrojádra (Vicia faba) Mechanismy reparace některých typů DNA lézí Reparace DNA a gen p53 Inhibitory reparace DNA Poruchy reparačních systémů • zvýšený výskyt malignit • přecitlivělost vůči látkám poškozujícím DNA • přecitlivělost vůči UV-záření • onemocnění nervového systému • některé poruchy imunitního systému Nemoci způsobené poruchami reparace DNA Nemoci způsobené poruchami reparace DNA Vrozené defekty DNA reparace a predispozice k nádorům Mutace a rakovina