„BOX titrace“ přímý test ELISA


Reakce:

Ag  +  AbE neboli Ab + Ab[S]E

Tato technika se používá pro stanovení optimální koncentrace vazebného Ag a konjugátu


Sérum

(μg/ml) ¯

Ab[S]

®

                                                 1

                                                 2

                                                 3

                                                 4

                                                 5

                                                 6

                                                 P

                                                 N

                                                 P

                                                 N

                                                 P

                                                 N

                                                 P

                                                 N

                                                 P

                                                 N

                                                 P

                                                 N

100

A

1,709

0,311

1,672

0,311

1,578

0,100

1,387

0,200

1,173

0,154

0,941

0,080

50

B

1,568

0,179

1,427

0,179

1,181

0,050

0,946

0,100

0,747

0,050

0,573

0,050

25

C

1,144

0,097

0,964

0,097

0,764

0,025

0,568

0,025

0,410

0,025

0,275

0,025

12,50

D

0,649

0,062

0,503

0,062

0,385

0,013

0,297

0,013

0,225

0,013

0,154

0,013

6,250

E

0,293

0,041

0,240

0,041

0,205

0,007

0,169

0,007

0,132

0,007

0,101

0,007

3,125

F

0,158

0,025

0,136

0,025

0,116

0,004

0,100

0,004

0,083

0,004

0,068

0,004

1,562

G

0,090

0,014

0,080

0,014

0,071

0,002

0,063

0,002

0,051

0,002

0,042

0,002

0

H

0,036

0,006

0,032

0,006

0,027

0,001

0,023

0,001

0,020

0,001

0,017

0,001



                                                 1

                                                 2

                                                 3

                                                 4

                                                 5

                                                 6

                                                 7

                                                 8

                                                 9

                                                10

                                                11

                                                12




tj Ab proti Ab[S] (tj. primární protilátka proti sekundární protilátce)

Sérum: Ab= Ag = sérum, a to buď

P = pozitivní sérum (=primární protilátka), nebo

N = negativní sérum (=bez primární protilátky)

Každá jamka musí obsahovat 100 μl, tj 50 μl protilátky a 50 μl konjugátu.


-         do řady A se aplikuje sérum v koncentraci 100 μg/ml

-         do řady B se aplikuje sérum v koncentraci 50 μg/ml, atd, do poslední řady H se nedává
sérum

-         do sloupce 1 se dává pozitivní kontrola (Ag = sérum s primární protilátkou)

-         do sloupce 2 se dává negativní kontrola (sérum) (Pozn.: pozitivní kontrola musí obsahovat
poměrně málo Ab (Ag), aby jejich hodnota byla uprostřed kalibrační křivky. V praxi to bývá okolo 10
– 20 μg/ml

-

Konjugát (Ab[S]E):

-         do sloupců 1 – 2 se aplikuje konjugát o určité koncentraci

-         do sloupců 3 – 4 se aplikuje konjugát o poloviční koncentraci

-         do sloupců 5 – 6 se aplikuje konjugát o čtvrtinové koncentraci (optimální koncentrace
konjugátu se pohybuje v rozmezí 0,1 – 10 μg/ml)

-         atd

Co se vyžaduje:

-         musí se nalézt podmínky testu tak, aby negativní kontroly měly absorbanci 0,05 – 0,150 a
maximální pozitivní hodnoty nad 1,0.Dodržování podmínek: vždy použít blank

a)    bez Ag, s Ab[s]

b)    bez Ab[s ]s Ag