TEORIE A ZADÁNÍ ÚLOH

A.   AMINOKYSELINY A BÍLKOVINY

Chování disociabilních skupin podstatně ovlivňuje vlastnosti aminokyselin a bílkovin:
                                  pKa1                            pKa2
         R‑CH‑COOH             R‑CH‑COO‑       R‑CH‑COO‑
                                                                          
              NH3+                            NH3+                    NH2

Disociační konstanty jsou uvedeny v tabulce I.

 Tabulka I: Disociační konstanty aminokyselin

AK              hodnota pKa

              	pKa1      pKa2     	 pKa boční řetězec
				       protonovaný 	–> deprotonovaný

Ala   	2.3       	9.9
Gly       	2.4       	9.8
Phe       	1.8       	9.1
Ser          	2.1       	9.2
Val          	2.3       	9.6
Asp        	2.0       10.0     	3.9 –COOH 		–> –COO-
Glu         	2.2       	9.7       	4.3 –COOH          	–> –COO-
His         	1.8       	9.2       	6.0 –imidazolium+ 	–> –imidazol
Cys        	1.8      10.8       	8.3 –SH                 	–> –S-
Tyr          	2.2       	9.1      10.9 –fenyl-OH		–> –fenyl-O-
Lys         	2.2       	9.2      10.8 ‑NH3+		–> –NH2
Arg        	1.8       	9.0      12.5 –guanidinium+	–> –guanidin
Asn           2.0       8.8
Gln            2.2       9.1
Trp            2.4       9.4
Leu           2.4        9.6
Ile             2.3        9.6
Met           2.3        9.2
Thr           2.2         9.1
Pro           2.0       10.6
IZOELEKTRICKÝ BOD

Hodnota pH, při kterém je aminokyselina elektroneutrální.

              N2+ = H.C        kde C je koncentrace aminokyseliny,
                       K2 + H           H je koncentrace H3O+ v izoelektrickém bodě

                	C1‑ = K1.C  
                                                            K1 + H

              	C1‑ = N2+

               	 H2 = K1K2          pI = 1/2 (pK1 + pK2)

Izoelektrický bod je aritmetickým průměrem pKa kyselé a bazické skupiny.

Výpočet  izoelektrického bodu pro bazickou aminokyselinu: pI = 1/2 (pK2 + pK3)
(pI bazické aminokyseliny je průměrem pKa obou bazických skupin)  
Výpočet  izoelektrického bodu pro kyselou aminokyselinu:   pI = 1/2 (pK1 + pK3)
(pI kyselé aminokyseliny je průměrem pKa obou kyselých skupin)
Výpočet izoelektrického bodu pro Tyr a Cys (K310-9): pI = -1/2 log(K1.K2+K1.K3)

Disociační rovnováhy aminokyselin a peptidů s několika disociabilními skupinami:

Peptidy zapisujeme od N-konce k C-konci.

Nejdůležitější L-aminokyseliny

Stanovení primární struktury bílkovin

Edmanovo odbourávání

Specifita enzymů a reagens hydrolyzujících peptidové vazby

Reagens	Místo hydrolýzy
	
Trypsin	Lys, Arg (C)	
Chymotrypsin	Phe, Trp, Tyr (C)	
Bromkyan	Met (C)	
Aminopeptidáza	odštěpení N-teminální aminokyseliny	
Karboxypeptidáza	odštěpení C-terminální aminokyseliny	

Sekundární struktura bílkovin

Sekundární struktura bílkovin je důsledkem její primární struktury.
Relativní pravděpodobnost, že se daná aminokyselina vyskytne v -šroubovici, skládaném listu nebo v reverzní smyčce je udána v následujícím grafu.

-šroubovice

0,54 nm na 1 závit
0,15 nm mezi dvěma aminokyselinovými zbytky

-skládaný list
0,36 nm mezi dvěma aminokyselinovými zbytky

1. Napište vzorce aminokyselin
a) majících aromatické jádro
b) obsahujících síru
c) majících při pH 7 celkový kladný náboj
d) majících při pH 7 celkový záporný náboj
e) majících alifatický řetězec
f) která aminokyselina nemá žádný asymetrický uhlíkový atom a která má dva asymetrické atomy? 

2. Zakreslete titrační křivku a popište inflexní bod
a) slabé kyseliny (kys. octové)
b) aminokyseliny (glycinu)

3. Vypočítejte procentuální obsah disociované formy karboxylové skupiny a NH3+ skupiny glycinu při pH: 3.0 a 11.0.
    (pKa1= 2.4, pKa2= 9.0)

4. Peptidová vazba mezi glycinem a threoninem může vzniknout dvěma způsoby. Napište vzorce obou variant. Analýzou bylo zjištěno, že izoelektrický bod jednoho z peptidů je při pH 6,38. O který peptid se jedná? Disociační konstanty glycinu: 
pKa1= 2,34, pKa2= 9,60
Disociační konstanty threoninu:
pKa1= 2,63, pKa2= 10,43 (Při výpočtu zanedbáme fakt, že disociační
konstanty koncových skupin dipeptidu se mohou po kondenzaci změnit)

 5. Odhadněte celkový náboj peptidu při pH 5 a při pH 9, Vypočítejte izoelektrický bod:
           Arg‑His‑Gly‑Phe‑Gly‑Glu‑Lys‑Tyr‑Cys‑Ala
Hodnoty pKa koncových disociabilních skupin jsou:
pKa1=3.6, pKa2=7.9

6. Jakého pH je nutno použít, aby se každý z peptidů pohyboval při elektroforéze na opačnou stranu. A. Ser‑Tyr‑Ser‑Met‑Glu‑His‑Phe‑Arg‑Gly
                           B. Val‑Cys‑Phe‑Glu‑Ala‑Lys‑Leu‑Gln‑Gly
Hodnoty pKa koncových skupin viz př.4

7. Následující směs aminokyselin byla podrobena elekroforéze.
Rozdělte aminokyseliny podle směru migrace při pH 3 a při pH 7:
           Gly, Ala, Glu, Lys, Arg, Ser, Asp, Asn

8. Směs aminokyselin byla nasazena na katex v 0.1 mol.l‑1 HCl. Napište,
které aminokyseliny se pravděpodobně zachytí a které z kolony vytečou.
Poté byla kolona promývána pufrem o pH 6. Které aminokyseliny se uvolní a které zůstanou vázány: Gly, Ala, Glu, Lys, Arg, Ser

9. Směs aminokyselin byla nasazena na anex při pH=11
          Arg, Ala, Glu, Tyr, Ser
a)	Jaký bude celkový náboj každé z aminokyselin? Které aminokyseliny se zachytí na koloně a které vytečou? 
b)	Poté byl na kolonu nasazen pufr o pH=8. Jaký bude celkový náboj každé aminokyseliny a které aminokyseliny z kolony vytečou? 

10. Směs aminokyselin byla nasazena na katex v 0.1 M HCl.
 Vypočítejte izolelekrický bod každé z aminokyselin.
 Napište pořadí, v jakém se budou tyto látky z kolony eluovat při postupném zvyšováni pH:
Glu, Ala, His, Lys, Tyr                     

11. Směs aminokyselin byla nasazena na anex při pH 10. Které aminokyseliny se nezachytí a které zůstanou vázány: Cys, Glu, Ser, Ala, Lys, His

12.  Jaké musí být pH pufru, aby bylo možno od sebe oddělit  tyto dva peptidy:

a) na sloupci katexu:        NH2‑Ala‑Glu‑Gly‑Tyr‑Lys‑COOH              (I)
           		                  NH2‑Gly‑Asp‑His‑Tyr‑Lys‑COOH    (II)

b) na sloupci anexu:        NH2.Ser.Tyr.Met.Glu.His.Phe.Arg.Gly.COOH             (III)
           		            NH2.Val.Cys.Phe.Glu.Ala.Lys.Leu.Gln.Gly.COOH  (IV)

Jaký bude náboj každého peptidu při tomto pH. Popište, zda se peptid zachytí na koloně nebo vyteče.

13. Směs aminokyselin byla nasazena na katex (Dowex 50) při pH 1.0. Eluce byla provedena gradientem rostoucího pH. Odhadněte pořadí eluce aminokyselin: Gly, Asp, Tyr, Ala, His, Arg

14. Tetrapeptid byl zpracován 2,4 DNFB a hydrolyzován. Značenou aminokyselinou byl 2,4‑DNFB‑valin a lysin. Hydrolýza trypsinem dala dva štěpy, z nichž první obsahoval aminokyselinu, která po redukci LiBH4 dává CH2(NH2)CH2OH a navíc obsahuje aminokyselinu, která se ninhydrinem barví žlutě. Určete sekvenci tohoto peptidu.

15.  Napište, jak byste stanovili sekvenci následujícího peptidu pomocí selektivní hydrolýzy trypsinem a 2,4-dinitrifluorbenzenu.

       NH2‑Ala‑Lys‑Glu‑Gly‑COOH

 Při dělení meziproduktu hydrolýzy trypsinem použijte metodu iontoměničové
 chromatografie, popište její podmínky.

16. Určete primární strukturu peptidu P na základě následujících reakcí:
a) redukce -merkaptoethanolem pokytne dva peptidy B a C
b) Po působení DNFB na peptid P a kyselé hydrolýze v přítomnosti -merkaptoethanolu získáme následující aminokyseliny: DNP-Asp, DNP-Leu, 2 Lys, 2 Cys, 1 Gly, 1 Glu, 1 Met, 1 Phe, 1 Ala
c) peptid B je podroben působení chymotrypsinu , získáme Ala, hydrolýza trypsinem dává 2 tripeptidy. Sangerova metoda aplikovaná na tyto 2 tripeptidy prokázala přítomnost DNP-Leu, DNP-Cys
d) působením bromkyanu na peptid C získáme Glu, trypsinolýza dává jeden dipeptid a jeden tripeptid: Sangerova metoda aplikovaná na tento tripeptid  prokázala přítomnost DNP-Asp
Jaká je struktura, B, C a P?

17.  Složení heptapeptidu  P je následující:
Glu, Ala, Lys, Arg, Cys, Met, Tyr
a) aminopeptidáza a karboxypeptidáza nemají žádný účinek
b) po působení chymotrypsinu vzniká jeden hexapeptid, který po Sangerově reakci dává DNP-Cys
c) po působení trypsinu vznikají dva peptidy: Jeden tripeptid, který po Sangerově reakci a hydrolýze dává DNP-Glu a DNP-Lys a dále jeden tetrapeptid, který působením aminopeptidázy uvolní nejdříve Met a potom Tyr
Určete sekvenci peptidu P

18. Polypeptid byl redukován -merkaptoethanolem a výsledkem reakce byly dva peptidy o následující sekvenci:
Asn-Cys-Phe-Thr-Lys-Lys-Trp-Cys-Arg-Ala-Val-Cys
Cys-Thr-Pro-Tyr-Cys-Phe-Pro-Cys
Nativní peptid byl hydrolyzován thermolysinem: Za experimentálních podmínek hydrolyzuje tento enzym peptidové vazby v místě aminoskupiny následujících aminokyselin: Leu, Phe, Trp, Tyr, Val. Byly získány 4 peptidy o tomto složení:

A) Asn, 2 Cys, Val
B) 2 Lys, Phe, Thr
C) Arg, Ala, Trp, Tyr, 2 Cys
D) 2 Cys, Thr,  2 Pro, Phe

Udejte polohu disulfidických můstků nativního peptidu

19. . Po tryptické hydrolýze určitého proteinu byl izolován oligopeptid P o následujícím složení:
1 Lys, 1 Asp(n), 1 Thr, 1 Glu(n), 1 Val, 1 Ile, 1 Phe, 1 Leu

Sumární náboj peptidu P při pH 6,5 je negativní. Po reakci peptidu s DNFB byl získán DNP-Thr. Karboxypeptidáza uvolňuje postupně tyto aminokyseliny: Lys, Leu, Ile, Val. Jestliže je peptid P hydrolyzován chymotryspinem, byl získán oligopeptid o následujícím složení: 1 Asp, 1 Val, 1 Leu, 1 Ile, 1 Lys
Udejte sekvenci P.

20. Primární struktura bílkoviny, jenž obsahuje prolin a úseky, ve kterých následuje několik aminokyselin se stejným nábojem, znemožňuje tvorbu -šroubovice. Odhadněte, které úseky následující bílkoviny by mohly mít sekundární strukturu -šroubovice: 
       ‑ Leu‑Ala‑His‑Thr‑Tyr‑Gly‑Pro‑Phe‑Glu‑Ala‑Ala‑Met‑Cys‑His‑
       ‑Glu‑Glu‑Asp‑Pro‑Asp‑Gly‑Met‑Gly‑Cys‑Ala‑Phe‑His‑

Jak by vypadala situace v případě poklesu pH pod oblast disociační konstanty karboxylových skupin. 

21. Určitý peptid je silným inhibitorem vedení nervového vzruchu. Analýza prokázala následující aminokyselinové složení: 5 Ala, Lys, Phe. Reakce intaktního peptidu s 2,4-DNFB prokázala po hydrolýze přítomnost DNF-alaninu. Štěpení pomocí trypsinu dalo tripeptid o (Lys, 2 Ala) a tetrapeptid (3 Ala, Phe). Štěpení pomocí chymotrypsinu poskytlo hexapeptid a volný fenylalanin. Napiště sekvenci tohoto peptidu.

22. Určitý protein o sekvenci Met-Ala-(Leu-Phe-Ala)3-(Leu-Met-Phe)3-Pro-Ans-Gly-Met-Leu-Phe je zakotven svým NH2 koncem v hydrofobním sektoru cytoplasmatické membrány. Pokuste se předpovědět jeho sekundární strukturu. Po mutaci byly všechny Leu zbytky nahrazeny Asp. Může to způsobit změnu sekundární struktury?

23. Při denaturaci bílkovin dojde vždy

                   a) ke změně primární struktury
                   b)     "    sekundární struktury
                   c)     "    terciární struktury
                   d)     "    kvarterní struktury
                   e)     "    molekulové hmotnosti

24. Jaká je délka bílkovinného řetězce obsahujícího 153 aminokyselin,
a) pokud byl byl zcela ve formě -šroubovice a zcela ve formě -skládaného listu
b) celková délka molekuly určité bílkoviny (153 aminokyselin) obsahující pouze -šroubovici a -skládaný list je 4,2 .10-6 cm. Vypočítejte, jaká frakce molekuly obsahuje -šroubovici. 

25. Jeden vlas roste průměrnou rychlostí 20 cm za rok. Vlas je tvořen -keratinem složeným z -šroubovice. Vypočítejte rychlost syntézy peptidových vazeb za jednu vteřinu. 

26. Buňka E. coli obsahuje 25 000 ribosomů.  Pokud by strukturální proteiny ze všech těchto ribosomů byly nataženy do maximální délky (-šroubovice), kolikrát by mohly ovinout buňku E. coli. Předpokládejte průměr ribosomů 18 nm o specifické hmotnosti 1, obsahující 40% hmotnosti strukturálních proteinů. Průměrná molekulová hmotnost aminokyseliny je 120. Buňka E. coli je sférická o průměru 1 m.  

27. Vypočítejte specifickou hmotnost molekuly tropokolagenu, kterou lze považovat za válec o délce 0,28 m a o průměru 1,4 nm. Obsahuje 3 polypeptidické řetězce se 1000 aminokyselinovými zbytky. Průměrná molekulová hmotnost 1 aminokyseliny je 120. 

28. Následující látky jsou velmi často používány při
    studiu bílkovin :
                       1/ CNBr
                       2/ močovina
                       3/ merkaptoethanol
                       4/ karboxypeptidáza
                       5/ 6 N HCl
                       6/ ninhydrin
		 7/ 2,4-dinitrofluorbenzen

     a) Která z nich se používá označení NH2 konce bílkoviny?
     b) Která by byla použita pro štěpení peptidické vazby na
    karboxylovém konci methioninu?
    c) Která by byla použita pro štěpení intermolekulárních nebo
    intramolekulárních disulfidických můstků?
   d) Která látka se používá pro potlačení vodíkových vazeb?

B. CUKRY

Nejdůležitější D‑sacharidy:

1. Nejjednodušší ketosa je  a) trehalosa      b) fruktosa
                             c) erythrulosa    d) dihydroxyaceton

2. Ketosy mají poloacetalový hydroxyl na uhlíku č.
                   a) 1     b) 2     c) 3    d) 6

3. Mutarotace je důsledkem přeměny 
		         a) aldosy na ketosu nebo naopak
                              b) hexosy na pentosu    "
                              c) formy D- na L-       "
                            d) formy  - na  -

4. Napište vzorce následujících disacharidů:
a) 	4‑O‑ ‑D‑glukopyranosyl‑D‑glukosa
b) 4‑O‑ ‑D‑galaktopyranosyl‑D‑glukosa
c) ‑D‑mannopyranosyl‑ ‑D‑glukopyranosid
d) 	4‑O‑ ‑D‑mannopyranosyl‑D‑galaktosa
e) 	‑D‑galaktopyranosyl‑ ‑D‑glukopyranosid

5. Která OH skupina glukosy je nejreaktivnější
Napište vzorec reakčního produktu D‑glukosy s methanolem v kyselém prostředí. 
Napište vzorec produktu reakce galaktosy se silnými alkylačními činidly (CH3I, dimethylsulfát). Tento produkt byl dále podroben mírné kyselé hydrolýze. Napište vzorec výsledné látky.

6. Napište vzorec produktu redukce D‑glukosy amalgámem sodíku. Napište
vzorec produktu oxidace D‑mannosy slabými oxidačními činidly (NaIO) a silnými oxidačními činidly (HNO3).

7. Laktosa byla methylována pomocí dimethylsulfátu a poté hydrolyzována zředěnou HCl. Napište vzorce produktů.
 
8. Kyselá hydrolýza trisacharidu dává D‑glukosu a D‑galaktosu v poměru koncentrací 2:1. Úplná methylace trisacharidu a následná hydrolýza dává tyto produkty: 
        2,3,6‑tri‑O‑methyl‑D‑galaktosa 
        2,3,4,6‑tetra‑O‑methyl‑D‑glukosa	
        2,3,4‑tri‑O‑methyl‑D‑glukosa
Napište vzorec trisacharidu (jsou možné dvě varianty).

9. 3‑O‑‑D‑mannopyranosyl‑D‑glukosa byla methylována pomocí dimethylsulfátu a pak hydrolyzována zředěnou HCl. Napište vzorce výsledných produktů. 

10. 6‑O‑‑D‑galaktopyranosyl‑D‑glukosa byla methylována pomocí dimethylsulfátu a pak hydrolyzována zředěnou HCl. Napište vzorce výsledných produktů.

11. Po methylaci disacharidu dimethylsulfátem a jeho hydrolýze zředěnou HCl byly získány následující sacharidy:

    2,3,4,6‑tetra‑O‑methylgalaktosa
    2,3‑di‑O‑methylribosa
    Napište vzorec tohoto disacharidu

12. Při úplné metylaci disacharidu a hydrolýze ve zředěné HCl byly získány následující produkty:
a)      1,3,6‑tri‑O‑metyl-D-fruktosa
         2,3,4,6‑tetra‑O‑metyl‑D‑galaktosa
         Napište vzorec tohoto disacharidu.

  b)    kys. 2,3,4‑tri‑O‑methylmannuronová
         2,3,4,6 tetra‑O‑methylglukosa

Napište vzorec tohoto disacharidu. (Předpokládejte, že eventuální methylester kyseliny se při hydrolýze v HCl zcela hydrolyzoval)

13. Napište vzorec: 3‑O‑ ‑D‑mannopyranosyl‑D‑fruktosy. Tento disacharid byl metylován pomocí metyljodidu a hydrolyzován v slabé HCl. Napište vzorec produktu.

C. LIPIDY

Nejdůležitější přirozené mastné kyseliny:

Fosfolipidy:

R =

1  Všechny lipidy jsou po chemické stránce
            a) amidy   b) estery   c) etery   d) acetaly

2.  Tekutost lipidů je úměrná obsahu
            a) vody     b) volného glycerolu
            c) nasycených mastných kyselin
            d) nenasycených mastných kyselin

3. Napište vzorce těchto mastných kyselin:
    	kys. olejová (18:19),   kys. linolová (18:29,12)
    	kys. palmitolejová (16:19)  kys. linolenová (18:39,12,15)

4. Napište vzorce těchto fosfolipidů:
a) kys. dipalmitoylfosfatidová
b) 1‑palmitoyl‑2‑oleylfosfatidylcholin
c) dipalmitoylfosfatidylethanolamin
d) 1‑stearoyl‑2‑palmitoylfosfatidylglycerol
e) dioleylfosfatidylserin
 	f) 1‑stearoyl-2‑linoloylfosfatidylserinu.
       	(kys. linolová 18:2 9,12.) 
 	g) napište vzorec 1‑palmitoyl-2‑oleylfosfatidylglycerolu.
       	(kys. olejová 18:1 9.) 

Jaký bude jeho celkový náboj při pH 7.5 (pKa fosfátu = 6.8, kys.fosforečná: pK1=2.2, pK2=7,2, pK3=12,3, serin: pKa1=2.1, pKa2=9.2).

5. Napište vzorec cholesterolu a očíslujte jej. 

6. 	Fosfolipidy jsou důležitými složkami biomembrán, kterým udělují kladné nebo záporné náboje. Jaký bude celkový náboj jednotlivých fosfolipidů a)‑c) v úloze 4, bude ‑li pH prostředí 5 a 8. (pKa fosfátové skupiny je v oblasti 6‑7). 

7. 	Vaječný lecithin je heterogenní směs diacylfosfatidylcholinů, z nichž 70% má v poloze 1 kys. palmitovou a 61% v poloze 2 kys. olejovou. Tento lecithin je dostupným zdrojem při syntéze definovaných fosfolipidů. Navrhněte metody syntézy:

        a) dipalmitoylfosfatidylcholinu
        b) 1‑palmitoyl‑2‑stearoylfosfatidylcholinu
c) 	distearoylfosfatidylethanolaminu

Použijte těchto údajů:

1. Selektivního odštěpení acylu v poloze 1 lze dosáhnout fosfolipázou A1, v poloze 2 fosfolipázou A2.
2. Chemicky lze obě mastné kyseliny odštěpit mírnou alkalickou hydrolýzou za katalýzy tetrabutylamonium hydroxidem.
3. 	Acylace glycerolu se provádí příslušnými acylchloridy.
4. 	Hydrolýzu vazby mezi fosfátem a bazí katalyzuje fosfolipasa D. Rovnovážná konstanta této reakce je rovna 1.

D   NUKLEOVÉ KYSELINY

Nukleové baze

Nukleosidy

Primární struktura nukleových kyselin

Metody stanovení sekvence nukleových kyselin:

Enzymy hydrolyzující nukleové kyseliny mohou být specifické na DNA, RNA,  nebo bez specifity

Fosfomonoesterázy: 
hydrolyzují teminální fosfátovou skupinu

Fosfodiesterázy: 
hydrolyzují fosfodiesterovou vazbu: 
	exonukleázy (5´- exonukleázy uvolňují 3´P nukleosidy,  3´- exonukleázy 	uvolňují 5´P nukleosidy)
	endonukleázy uvolňují oligonukleotidy, jsou obvykle substrátově specifické (desoxyribonukleáza, ribonukleáza)

Polynukleotidkináza: Fosforyluje volnou 5´OH skupinu pentózy pomocí ATP

Maxam-Gilbertova metoda sekvenace nukleových kyselin.:

1. Označení konce nukleové kyseliny pomocí ATP (32P)
2. Specifická chemická hydrolýza v místě:
	G: působením DMS za tepla
	G + A: působením kyseliny a DMS
	C: působením hydrazinu v prostředí 5 M NaCl
	C + T: působením hydrazinu
3. Elekroforéza získaných fragmenů za denaturačních podmínek (rychlost migrace je nepřímo úměrná počtu nukleotidů)
4. Autoradiografie gelu

Sekundární struktura DNA

Základní strukturou DNA je dvojitá šroubovice stabilizovaná vodíkovými vazbami mezi A-T a G-C. 
Dvojitá šroubovice obsahuje 10 pb na jednu otáčku a vzdálenost mezi dvěma následujícími pb je 0,34 nm.
(méně běžná A-šroubovice DNA obsahuje 11 pb/otáčka a vzdálenost mezi sousední bazemi je 0,23 nm.
Z-šroubovice DNA obsahuje 12 pb/otáčka a vzdálenost mezi sousedními pb je 0,38 nm).

Genetický kód mRNA prokaryontů:

1. Napište vzorce adeninu, nukleosidu a nukleotidu od něho odvozeného

2. Roztok obsahující AMP a GMP měl absorbanci A260 = 0.652 a A280 = 0.284, vypočítejte koncentraci AMP a GMP v roztoku, jestliže pro AMP je  při 260 = 15.4 x 103 M-1.cm-1,  při 280 = 2.5 x 103 M-1.cm-1.  Pro GMP  při  260= 11.7 x 103 M-1.cm-1,  při 280 = 7.7 x 103 M -1.cm-1.

3. Napište úplnou strukturu ribodinukleotidu a desoxyribodinukleotidu složeného z A a C. 

4. Vypočítejte průměrnou molekulovou hmotnost jednoho nukleotidového zbytku DNA a RNA, za předpokladu, že baze jsou přítomny v ekvimolárních koncentracích.  Nezapomeňte na kondenzaci vody při vytvoření esterové vazby!
(Molekulové hmotnosti složek: A = 135,  G = 151, C = 111,  U = 112, T = 126, ribóza 150, kys. fosforečná = 98). 

5. Schematické znázornění sekvence RNA (zapsáno od volného 3' konce k 5' konci) je následující:

UpCpUpApGpAp

Napište produkty hydrolýzy této RNA pomocí následujících enzymů:

a) fosfomonoesteráza
b) fosfodiesteráza hadího jedu  (3´- exonukleáza)
c) fosfodiesteráza ze sleziny (5´- exonukleáza)
d) ribonukleáza T1 (hydrolýza v místě G, vznik 3´P oligonukleotidu)
e) ribonukleáza U2 (hydrolýza v místě A nebo G, vznik 3´P oligonukleotidu)

6. Oligonukleotid pocházející z DNA má následující sekvenci (zapsáno od volného 5' konce k 3' konci):

pApCpTpTpApG

5´ terminální nukleotid byl označen 32P. Jaké oligonukleotidy získáme po působení fosfodiesterázy hadího jedu (viz výše). Které z nich budou značeny 32P?
Které oligonukleotidy získáme hydrolýzou pomocí desoxyribonukleázy II a které z nich budou značeny 32P (desoxyribonukleáza II je endonukleáza uvolňující  3´P oligonukleotidy). 

7. Oligoribonukleotid X je složen z následujících bazí: 2A, 2C, U, G.
a) po působení fosfodiesterázy z hadího jedu se po krátké době uvolní pC.
b) hydrolýzou pomocí pankreatické ribonukleázy získánme C, dinukleotid obsahující A a C a dále trinukleotid obsahující A, G a U.
(penkreatická ribonukleáza je endonukleáza a působí v místě C a U za vzniku 3´P oligonukleotidů). 
c) hydrolýzou pomocí ribonukleázy T2 (hydrolýza v místě A za vzniku 3´P oligonukleotidů) získáme  pAp, dinukleotid obsahující U a C a trinukleotid obsahující A, G a C.
Určete sekvenci oligoribonukleotidu

8. Udejte sekvenci oligodesoxyribonukleotidu stanovovanou Maxam-Gilbertovou metodou. Po autoradiografii byl získán následující obraz:

 		G + A		G		C + T		C

start

                                                                                                    

9. Při replikaci řetězce DNA  --AGCGTAG-- byl vytvořen komplementární řetězec o jaké sekvenci ? Jaká bude sekvence RNA vytvořená při transkripci.

10. Napište sekvenci komplementární k uvedenému řetězci DNA, vyhledejte úseky obsahující palindrom. 

a/ GATCAA,  b/ TGGAAC,   c/ GAATTC,  d/ ACGCGT,  e/ CGGCCG,
f/ TACCAT

11. Vypočítejte molekulovou hmotnost jednoho průměrného páru bazí
(molekulová hmotnost A = 135, T = 126, G = 151, C = 111, desoxyribóza 134, kys. fosforečná 98. Nezapomeňte na odštěpení vody při tvorbě esterové vazby)
Jaká je molekulová hmotnost molekuly DNA o délce 1 m v Da a hmotnost v gramech?

12. Jaterní buňka krysy obsahuje 10-11 g DNA. Tato DNA je rovnoměrně rozdělena do 42 chromosomů buňky.
a) Jaká je molekulová hmotnost DNA (1 chromosom obsahuje jednu molekulu DNA).
b) Vypočítejte počet párů bazí DNA obsažené v jednom chromosomu a jeho délku (vzdálenost mezi dvěma následujícími pb je 0,34 nm, molekulová hmotnost jednoho páru bazí je v průměru 617,5).

13. Molární složení guaninu + cytosinu v DNA určité bakterie je 67,2%. Jaký je poměr mezi purinovými a pyrimidinovými bazemi? Jaké je molární složení v procentech jednotlivých bazí této DNA. 

14. Při analýze byla zjištěna změna v aminokyselinovém složení  bílkoviny, jejíž gen byl mutován. Vyberte z následujících změn ty případy, které jsou výsledkem mutace provedené změnou jedné baze.
Phe  Leu	Lys  Ala	Ala  Thr	Phe  Lys	Ile  Leu
His  Glu 	Pro  Ser

15. DNA fága lambda vzniklá deleční mutací má délku 13, 6 m namísto 16, 49 m. 
a) Vypočítejte, kolik pb tomuto mutantovi chybí
b) Jaký je rozdíl v molekulové hmostnosti a hmotnosti v gramech obou DNA 
c) Část, u které byla provedena delece odpovídá sekvenci kódující protein P. Jaká je molekulová hmotnost tohoto proteinu. Průměrná molekulová hmotnost aminokyseliny je 140.

16. Směs nukleosidtrifosfátů značených 32P na -fosfátu byla inkubována s RNApolymerázou: Po určité době byla zjištěna inkorporace 100 molekul značeného fosfátu do výsledného produktu. Tentýž pokus byl proveden se směsí nukleosidtrifosfátů značených na fosfátu . Byla zjištěna inkorporace 3.104 molekul fosfátu do značeného produktu. 
Jaký počet řetězců RNA byl syntezován a jaká je jejich průměrná délka?

17. Aminokyselinová sekvence C-terminální oblasti bílkoviny a odpovídající kódující sekvence DNA jsou následující:
Phe-Glu-Ile-Leu-Glu-Arg-Arg
TTT GAG ATT CTG GAG CGG CGG
Popište mutace, které by mohly vnést do této sekvence restrikční místo TT/CGAA
a jiné restrikční místo A/GATCT a to za podmínky, že nedojde ke změně sekvence aminokyselin ve vzniklém peptidu. 

18. DNA bakteriofága má následující složení bazí: C 19%, A 25%, T 33% a G 23%. 
a) Co je na této DNA neobvyklé a čím se dá její struktura charakterizovat
b) Tato DNA byla použita jako matrice in vitro při reakci katalyzované DNA polymerázou. Jaké bude složení bazí této nově syntezované DNA?
c) pokud by množství nasyntezované DNA bylo stejné jako je množství matrice, jaké je celkové složení bazí (to je DNA matrice + DNA syntezované in vitro)
d) mRNA syntezovaná jakožto odpověď na infekci fágem má následující složení: C 18%, A 25% U 34% G 23%. Který řetězec DNA byl použit pro syntézu RNA?

19. Byla provedena syntéza polynukleotidu mRNA in vitro za použití 90% UTP a 10% CTP.  Tyto polymerní molekuly byly poté použity pro syntézu polypeptidu za přítomnosti všech 20 t-RNA. Syntezované polypeptidy byly hydrolyzovány a jejich celkové aminokyselinové složení bylo následující: 81% Phe, 1% Pro, 9% Ser, 9% Leu. 
Vypočítejte frekvenci všech kodonů a zdůvodněte odpovídající aminokyselinové složení polypeptidů.

20. Při pokusu byla enzymově připravena glutaminyl-tRNA značená na glutaminu. Poté byla tato látka chemicky desaminována za vzniku glutamyl-tRNA. Tato tRNA byla přidána do bezbuněčné směsi připravené z E. coli a zbavené mRNA. Ke směsi byl přidán uměle připravený polymer obsahující ekvimolární koncentraci G a A. Kolik procent glutamátu bude obsahovat syntezovaný polypeptid? 

21. Při stanovení primární struktury enzymu bylo zjištěno, že se skládá z 250 aminokyselin. Jaký je minimální počet nukleotidů strukturálního genu tohoto enzymu? Při bodové mutaci tohoto strukturálního genu došlo k náhradě jednoho serinu glutamátem. Tento fakt se projevil ztrátou enzymové aktivity. Co z tohoto faktu lze vyvodit?

E.  TERMODYNAMIKA ENZYMOVÝCH REAKCÍ

Základní vztahy:
                                E
                     A + B     C  +  D

            G = Go + RTln [C][D]         R=8,314 J.K‑1.mol‑1
                                        [A][B]
                    povaha      aktuální
                    reakce      koncentrace

                    Go = ‑RTln Keq

Tab.II    Hodnoty  Go hydrolýzy důležitých vazeb

                                            	    		Go [kJ.mol‑1]

fosfoenolpyruvát    	pyruvát 			‑61.8 
karbamoylfosfát     	karbamát             		‑51.4
acetylfosfát            	k.octová 	              	‑43.0
kreatinfosfát            	kreatin             		‑43.0
difosfát                    	fosfát              		‑33.4
acetylKoA               	acetát              		‑31.3
ATP                         	ADP			-30,5
ADP                         AMP                		‑30.5
glukosa‑1‑P             glukosa             		‑20.9
Glukosa‑6‑P            glukosa 	            	‑12.5
glycerol‑3‑P             glycerol             	   	  ‑8.4

1. Vypočítejte Go reakce přeměny dihydroxyacetonfosfátu na glyceraldehydfosfát, je‑li Keq= 0.0475 při 25oC. Vypočítejte G reakce, je‑li koncentrace dihydroxy AP 2.10‑4mol.l‑1 a glyceraldehyd P 3.10‑6 mol.l‑1. 

2. Vypočítejte G hydrolýzy ATP na ADP a Pi, jsou‑li koncetrace ADP a ATP ekvimolární a koncentrace fosfátu při 25 oC: a) 1 mol.l‑1, b) 0.001 mol.l‑1.
c) Jaká je G hydrolýzy za aktuálních podmínek hydrolýzy ve svalu, kde je koncentrace ATP = 5 mmol.l‑1, ADP = 0.5 mmol.l‑1, Pi= 1 mmol.l‑1při 25oC. 

Vzorce některých energeticky významných sloučenin:

3. Vypočítejte G hydrolýzy difosfátu na fosfát, je‑li aktuální koncentrace difosfátu 1 mmol.l‑1, koncentrace fosfátu 150 mmol.l‑1. Go reakce je ‑33.4 kJ.mol‑1, teplota 25oC. Vypočítejte rovnovážnou konstantu reakce.

4. Jaká musí být koncentrace malátu, aby reakce:

                     malát  fumarát + H2O

byla v rovnováze. Koncentrace fumarátu je 1 mmol.l‑1, Go reakce je +3.1 kJ.mol‑1, t= 25oC.

Spřažené reakce:

         G1     A  C + D     K1= [C].[D]
                                                   [A]
         G2     C  G         K2= [G]
                                               [C]

         G1+2   A  D + G     K1+2= [D].[G] = K1.K2
                                                       [A]

                                 Go1+2= ‑RTln K1+2= ‑RT(lnK1+lnK2) 
                                 Go1+2=  Go1 + Go2
                                 G1+2 =  Go1+2 + RT ln [D].[G]
 					                    [A]        

5. Vypočítejte  Go a Keq reakce při 25oC:

              ATP + CH3COCOOH   ADP + CH2C(OP)‑COOH

Jaký je rovnovážný poměr koncentrací pyr/PEP, je‑li poměr ATP/ADP=10.

6. Tvorba acetyl‑KoA probíhá v přítomnosti ATP:

        CH3COOH + ATP + HSKoA   CH3COKoA + AMP + PPi

(PPi je difosfát).

Vypočítejte  Go reakce (předpokládejte, že  Go hydrolýzy
ATP‑ AMP + PPi je stejné jako při vzniku ADP a Pi. PPi je hydrolyzován pyrofosfatázou. Vypočítejte celkové Go reakce při 25oC. Jaký je vliv hydrolýzy difosfátu? 

7. Vypočítejte  Go izomerace:

                    glukosa‑6‑P  glukosa‑1‑P

Jaký je rovnovážný poměr koncentrace obou látek při 25oC. Jaké je G reakce,je‑li koncentrace glukosa‑6‑P 10 mmol.l‑1 a koncentrace glukosa‑1‑P 2 mmol.l‑1?  

8. Kreatinfosfát je hlavní zásobní látkou svalu. Jaké je  Go  reakce:

                 ATP  + kreatin  ADP + kreatinfosfát.

Jaký je rovnovážný poměr kreatin‑P/kreatin při 25oC, jsou‑li koncentrace ADP a ATP ekvimolární. Napište vzorec kreatinfosfátu.  

9. Koncentrace glukosy v buňce je 1 mmol.l‑1, koncentrace glukosa‑1‑P 0.05 mmol.l‑1.
Jaký musí být poměr koncentrací ATP/ADP. aby reakce:

                 ATP  + glukosa   glukosa‑1‑P + ADP

byla při 25oC v rovnováze.

10.  Vypočítejte Go reakce při 25oC:

        sacharosa + Pi  glukosa‑1‑P + fruktosa

K dispozici máte tyto údaje:

        1/ sacharosa   glukosa + fruktosa  K= 1.35.105
        2/ glukosa‑1‑P  glukosa + Pi  Go = ‑20.9 kJ.mol-1

Jaká bude volná energie reakce G za aktuálních podmínek:   
Koncentrace Pi 1 mmol.l-1, sacharosa 0.5 mmol.l-1, glukosa‑1‑P a fruktosa 4 mmol.l-1.
Je možno glykosidovou vazbu sacharosy počítat mezi makroergickou vazbu, pokud mezi makroergické vazby počítáme vazby se standartní volnou energií hydrolýzy nižší než ‑10 kJ.mol-1?  

11. Vypočítejte stand. volnou energii tvorby aktivované glukosy při 25°C:

            glukosa‑1‑P + ATP  ADP‑glukosa + PPi

K dispozici máte tyto údaje:

            rovnovážná konstanta hydrolýzy:
            1/ ADP‑glukosa  glukosa + ADP    K= 722
            2/ ATP  ADP + Pi  Go= ‑ 30.5 kJ/mol
            3/ glukosa‑1‑P  glukosa + Pi  Go = ‑20.9 kJ.mol-1
            4/ hydrolýza PPi:   PPi  2Pi  Go = ‑33.4 kJ.mol-1

Vypočítejte G hydrolýzy difosfátu za aktuálních podmínek koncentrace při 25oC: Pi = 5 mmol/l, PPi = 2 mmol.l-1.

12.  Vypočítejte stand. volnou energii hydrolysy aktivované glukosy při 25°C:

            ADP‑glukosa   glukosa + ADP

K dispozici máte tyto údaje:

        	1/ Glukosa‑1‑P + ATP   ADP‑glukosa + PPi     Keq = 2
       	2/ hydrolýza difosfátu:  PPi   2Pi  Go = ‑ 33.4 kJ.mol-1
        	3/ Glukosa‑1‑P   glukosa + Pi    Go = ‑20.9 kJ.mol-1
        	4/ ATP  ADP + Pi    Go= ‑30.5 kJ.mol-1

13.   Dokažte výpočtem, zda bude probíhat tato reakce:

   	glukosa-6-P  fruktosa‑6‑P 

je‑li Go = +1,6 kJ.mol-1 a koncentrace fruktosa‑6‑P 10 mmol.l-1 při 25°C, koncentrace glukosa-1-P je 1 mmol.l-1.  Napiště vzorce glukosa-1-P a fruktosa-1-P.                    

14. a)  Jedním ze způsobů jak může svalová buňka zvýšit koncentraci ATP je následující reakce:

      2 ADP  ATP + AMP

Vypočítejte, zda je tato reakce za standardních podmínek exergonická nebo endergonická, pokud předpokládáte, že Go hydrolýzy u dvou fosfátových vazeb nukleotidu je stejná  -30 kJ.mol-1.
      b)  Jak by tomu bylo v případě, kdyby Go fosfátu č.2 byla -28 kJ.mol-1? 
Vypočítejte hodnotu G výše uvedené reakce za aktuálních koncentrací:

ATP  0,1 mmol.l-1,   ADP 1 mmol.l-1, AMP  0,05 mmol.l-1.

F   ENZYMY

Hlavní skupiny enzymů podle typu reakce:

1. 	Oxidoreduktasy                    
    
A-+ B  A + B-                      				2. Transferasy
    
    								A-B  + C    A + B-C

3. Hydrolasy

    A-B + H2O  A-H + B-OH           			4. Lyasy (synthasy)

  							            X   Y
                    
  								 A –B     A ==B  + X-Y

5. 	Izomerasy

    X   Y       Y   X
                      
   A –B    A - B  						6. Ligasy (synthetasy)

   								A + B   A-B

 SYSTEMATICKÉ NAZVOSLOVÍ ENZYMů

1.	Oxidoreduktasy
donor:akceptor-oxidoreduktasa
(např. glukosa:O2-oxidoreduktasa, triviálně glukosaoxidasa)

2.	Transferasy
donor:akceptor-skupinatransferasa
(např. ATP:glukosa-6-fosfotransferasa, triviálně glukokinasa či hexokinasa)

3.	Hydrolasy
substrát-skupinahydrolasa
      (např. protein-amidohydrolasa, triviálně proteinasa)

4.	Lyasy (synthasy)
substrát-skupinalyasa
      (např. citrát-oxalacetátlyasa, triviálně citrátsynthasa)

5.	Isomerasy
         neujasněné názvosloví, enzym může končit názvem:
         racemasa (katalyzuje stereochemické změny substrátu, např.alaninracemasa)
         epimerasa (např. UDP-glukosa-4-epimerasa)
         isomerasa (obecně substrát-děj-isomerasa, např. maleinát-cis-trans-isomerasa)
         mutasa (chorismátmutasa)
         
6.	Ligasy (syntetasy)
substrát:substrát-ligasa(tvořící nukleotid)   
(např. alanin:tRNAAla-ligasa(tvořící AMP), triviálně alanyl-tRNA-synthetasa)

 KINETIKA ENZYMOVÝCH REAKCÍ

                              k1           k2
                  E + S      ES     E + P
                             k‑1

                  Km= k‑1+ k2        Michaelisova konstanta
                             k1
      
Je‑li k2  k‑1,  pak Km= k‑1     Disociační konstanta
                                  k1      komplexu ES

                  vo= k2[ES]

                   vo=   V.S          Rovnice Michaelise‑Mentenové
                        Km + S

      Platí‑li, že S    , 
      pak  [Et] = [ES]
                 vo= k2[Et] = V      Limitní počáteční rychlost

Limitní počáteční rychlost je tedy přímo úměrná koncentraci enzymu.
Pomocí této limitní rychlosti (S   , T, pH optimum) lze měřit množství enzymu, tzv. aktivitu. 

Aktivita enzymu se udává v následujících jednotkách :    1 IU      = 1 mol.min‑1
                                                                                          1 katal = 1 mol.s‑1         
Číslo přeměny=katalytická aktivita=molekulová (resp.molární) aktivita enzymu=počet molekul (resp.molů) substrátu přeměněných za jednu sekundu jednou molekulou (resp.jedním molem) enzymu.

Stanovení Km a V ‑ linearizované vztahy:

                  1 = Km.1 + 1 Vynesení podle Lineweavera‑Burka 
                  vo  V   S    V

                  S = S    + Km      Vynesení podle Hanese‑Woolfa
                  vo    V       V

Enzymová inhibice

Inhibice kompetitivní:

                            Km
                  E + S     ES    E + P
                            Ki
                  E + I      EI

Jestliže S   , pak EI  0 , a vo = V
Linearizované vztahy:

                  1 = Km.(1 + i/Ki).1 + 1
                  vo    V                 S   V

                  S = S + Km(1 + i/Ki)
                  Vo  V      V

Inhibice nekompetitivní:
                           Km
                  E + S    ES   E + P

                           Ki       +S
                  E + I    EI    EIS

                            Km        +I
                  E + S    ES     EIS

Linearizované vztahy:

                  1 = Km.(1 +i/Ki).1 + 1.(1 + i/Ki)
                  vo    V               S    V

                  S = S (1 + i/Ki) + Km (1 + i/Ki)
                  vo    V                   V

1. Enzymy v uzavřeném systému
         a) posunují rovnováhu reakce ve směru tvorby produktu
         b) neovlivňují rovnovážný stav reakce
         c) zvyšují  Go reakce
         d) snižují      "

2.  Pojmenujte enzymy katalyzující následující reakce a zařaďte je podle enzymové nomenklatury (tj. hydrolasa, transferasa, oxidoreduktasa, apod.):

    a) oxalacetát + NADH + H+  malát + NAD+
    b) glutamát + pyruvát  oxoglutarát + alanin
    c) škrob  (maltosa)n
    d) formaldehyd + NADH + H+  methanol + NAD+
    e) fruktosa + ATP  fruktosa-6-fosfát + ADP
    f)  močovina + H2O  amoniak + CO2
g) 	Glukosa-6-fosfát  Glukosa 1-fosfát
h) 	D-alanin + D-alanin + ATP  D-alanyl-D-alanin + ADP + P

 3. Vysvětlete rozdíl mezi koenzymem a prostetickou skupinou. Vysvětete roli koenzymu A v metabolismu, vysvětete roli pyridoxalfosfátu.

4. Glukokinasa a hexokinasa jsou enzymy katalyzující tutéž reakci:

                  ATP + glukosa   glukosa‑6‑P + ADP

Glukokinasa z jater má Km pro glukosu 10 mmol.l‑1, katalytická aktivita je 1.5 mol.min‑1. Hexokinasa má Km 0.1 mmol.l‑1, katalytická aktivita je 0.1 mol.min‑1. Vypočítejte počáteční rychlost přeměny glukosy při její následující koncentraci (ATP je v nadbytku) a srovnejte hodnoty pro oba enzymy. 
a) 0.1 mmol.l‑1
b) 1 mmol.l‑1
c) 5 mmol.l‑1   normální hodnota
d) 30 mmol.l‑1  diabetes

5. a) Aktivita enzymu v roztoku je 0.2 mol.min‑1, Michaelisova
konstanta enzymu pro daný substrát je 0.2 mmol.l‑1. Vypočítejte jakou počáteční rychlostí bude enzymová reakce probíhat, je‑li koncentrace substrátu 0.005 mmol.l‑1.
    b) K enzymu byl přidán kompetitivní inhibitor o koncentraci 0,1 mmol.l‑1, Ki= 0.2 mmol.l‑1.Jakou rychlostí bude reakce probíhat, bude‑li koncentrace substrátu 20 mmol.l‑1.
   c) K enzymu byl přidán nekompetitivní inhibitor o koncentraci 0.005 mol.l‑1. Jakou rychlostí bude reakce probíhat, budou‑li reakční podmínky stejné jako v bodu b) ?

6. Předpokládejte, že enzym katalyzuje reakci:
                k1           k2
   E + S      ES    E + P
                k-1          k-2

kde k1 = 109 M-1s-1, k-1 = 105 s-1, k2 = 102 s-1, k-2 = 107 M-1s-1, a celková koncentrace enzymu Et = 0,1 nM. Vypočítejte následující hodnoty:
Km, V max, katalytickou aktivitu (číslo přeměny), počáteční rychlost, je-li koncentrace substrátu 20 M

7.  Na základě měření vypočítejte kinetické parametry enzymu, tj. Km
a maximální počáteční rychlost 
    konc. substrátu (mol.l‑1)   vo (mol.min‑1)

    0.3.10‑5                    	10.4
    0.5.10‑5                    	14.5
    1.10‑5                     	22.5
    3.10‑5                     	33.8
    9.10‑5                      	40.5

8.  a) V přítomnosti inhibitoru o koncentraci 0.01 mmol.l‑1 byly naměřeny tyto počáteční rychlosti přeměny substrátu (viz úloha 7): 

 konc. substrátu (mol.l‑1)    vo (mol.min‑1)

    0.3.10‑5                      	3.96
    0.5.10‑5                      	5.75
    1.10‑5                        	8.70
    3.10‑5                            13.00
    9.10‑5                            15.80

Určete typ inhibice a vypočítejte Ki

    b) V přítomnosti druhého inhibitoru 2 mmol.l‑1 byly naměřeny tyto počáteční rychlosti: 

    konc. substrátu (mol.l‑1)    vo (mol.min‑1)

    0.3.10‑5                     	  4.1
    0.5.10‑5                     	  6.4
    1.10‑5                       	11.3
    3.10‑5                      	22.6
    9.10‑5                      	33.6

Vypočítejte Ki a určete typ inhibice.

9.  Z následující údajů o enzymové reakci určete graficky případně početně typ inhibice, Km enzymu a Ki.

    koncentrace substrátu                vo (nkat)

         mmol.l-1                  bez inhibitoru   inhibitor (6 mmol.l-1)

        2.0                             139             88
        3.0                             179            121
        4.0                             213            149
       10.0                             313            257
       15.0                             370            313

Jak byste daný typ inhibice zrušili ?

10 a) Při kinetickém měření závislosti reakční rychlosti na koncentraci substrátu byly zjištěny následující hodnoty:

S(mmol.l-1)   		vo (mmol.min-1)
       0,1        			 0,046
       0.2        			0,086
       0,4         			0,150
       1,0        		 	0,270
       2,0         			0,370

Vypočítejte Michaelisovu konstantu enzymu pro tento substrát.

 b) V přítomnosti koncentrace inhibitoru 1 mmol/l byly zjištěny tyto údaje:

       Substrát (mmol.l-1)  	Vo(mmol.min-1)	

       0,1              		0,019
       0,2               		0,037
       0,4               		0,070
       1,0               		0,150
       2,0               		0,239

    Určete, o jaký typ inhibice se jedná. Vypočítejte Ki inhibitoru.

11. Určete Km a aktivitu enzymu na základě kinetických měření

       	S ( mol.l-1)   	Vo (mol.min-1)
       	0.0003       	0.026
       	0.001        	0.054
      	0.002        	0.070

V přítomnosti koncentrace inhibitoru 0.01 mmol.l-1 byly naměřeny tyto hodnoty. Vypočítejte Ki a určete typ inhibice:

 	S (mmol.l-1)	Vo (mol.min-1)	
       	0.0003       	0.011
       	0.001        	0.023
       	0.002        	0.030

12. Vypočítejte Michaelisovu konstantu a maximální rychlost reakce na základě kinetických měření:

    substrátu (mol.l-1)    počáteční rychlost (nkat)
    1.10‑4                 	0,45
    5.10‑4                 	2,3
    2.10‑3                 	5,3
    4.10‑3                 	6,5

K enzymu byl přidán nekompetitivní inhibitor o koncentraci 4.10‑4 mol.l-1, Ki inhibitoru 1.10‑3 mol.l-1. Vypočítejte rychlost enzymové reakce, je‑li koncentrace substrátu 2.10‑3 mol.l-1.

13. Aktivita enzymu v roztoku je 0.2 umol.min-1, Michaelisova konstanta enzymu pro daný substrát je 0.2 mmol.l-1. 
a) Vypočítejte jakou počáteční rychlostí bude enzymová reakce probíhat, je‑li koncentrace substrátu 0.005 mmol.l-1.
b) K enzymu byl přidán kompetitivní inhibitor o koncentraci 0.1 mmol.l-1, Ki= 0.2 mmol.l-1. Jakou rychlostí bude reakce probíhat, bude‑li koncentrace substrátu 20 mmol.l-1. 

c) K enzymu byl přidán nekompetitivní inhibitor o koncentraci 0.1 mmol.l-1,  Ki= 0.2 mmol.l-1. Jakou rychlostí bude reakce probíhat, bude‑li koncentrace substrátu 20 mmol.l-1.

14. Vypočítejte, jakou aktivitu (umol/min) bude mít 2.5.10‑4 mg zcela čistého enzymu o molek. hmotnosti 400 000, je‑li molekulární aktivita (číslo přeměny 2500 sec‑1).

15. Vypočítejte molekulární aktivitu enzymu (číslo přeměny), jestliže 5.10‑4 mg zcela čistého enzymu má aktivitu 2O mezinárodních jednotek. Molekulová hmostnost enzymu je 240000.

16. K roztoku glutamátdehydrogenasy o aktivitě 5 nkat byl přidán glutamát a změřena počáteční rychlost reakce 1.5 nkat. Kolik procent enzymu je vázáno ve formě komplexu enzym‑substrát? (Km = 2,25 mmol.l‑1).

17. Koncentraci jablečnanu ve vzorku by bylo možno stanovit pomocí příslušné dehydrogenasy citrátového cyklu na základě vznikajícího NADH:

              jablečnan + NAD  NADH + H+ + oxalacetát

Průběh reakce je závislý na pH prostředí. Rovnováha reakce je silně posunuta na levou stranu (K = 5.lO‑13 mol.l‑1). Vypočítejte, jaké pH pufru je nutno zvolit, aby alespoň 90% jablečnanu bylo přeměněno na oxalacetát. Reakční podmínky: počáteční koncentrace NAD = 5 mmol.l‑1, počáteční koncentrace jablečnanu 0,1 mmol.l‑1.

 VÝSLEDKY ÚLOH

A. 
1.	a) Phe, Tyr, Try, His
b) Cys, Met
c) His, Lys, Arg
d) Ala, Gly, Phe, Ser, Val, Asp, Glu, Cys, Tyr, Asn, Gln, Try, Leu, Ile, Met, Thr, Pro
e) Gly, Ala, Leu, Ile, Val
f) žádný asymetrický uhlíkový atom: Gly
   dva asymetrické uhlíkové atomy: Ile, Thr
2.
3. 	postupná disociace glycinu: A+ A  A-
K1=[A].[H+]/[A+] 
K2=[A-].[H+]/[A]
Vztahy pro disociační konstanty se pak využijí k výpočtu procenta disociované formy (po dosazení za jednotlivé formy glycinu se [A] nakonec vykrátí):
[A].100/([A+]+[A]+[A-])=79.9% disociované formy karboxylové skupiny při pH=3
[A].100/([A+]+[A]+[A-])=0.99% NH3+ při pH 11
4. 	NH2-Thr-Gly-COOH; pI=6,385 (pro NH2-Gly-Thr-COOH by byl pI=6,115)
 5.  Přibližný náboj jednotlivých aminokyselin v peptidickém řetězci lze určit na základě disociačních konstant postranních skupin. Pokud je uvažované pH roztoku vyšší než hodnota pK3 postranní -COOH skupiny, pak proběhne její disociace na -COO-. Pokud je pH roztoku nižší než pK3 postranní aminoskupiny, pak tato skupina přejde na formu -NH3+.
      při pH=5:
      Arg++-His+-Gly0-Phe0-Gly0-Glu1--Lys+-Tyr0-Cys0-Ala1-, celkem 2+
      při pH=9:
      Arg1,5+-His0-Gly0-Phe0-Gly0-Glu1--Lys+-Tyr0-Cys1--Ala1-, celkem 0-1-
      Z výše uvedeného vyplývá, že pI tohoto peptidu se nachází mírně pod pH=9. Hodnotu  pI lze spočítat pouze přibližně, protože nemáme možnost brát v úvahu vliv sekundární struktury peptidu, vliv ostatních aminokyselinových zbytků na hodnoty disociačních konstant apod. Při porovnání disociačních konstant jednotlivých disociabilních skupin peptidu zjistíme, že nejvíce se pH9 přibližují: disociační konstanta argininu pK2=9,0 a disociační konstanta cysteinu pK3=8,3. Právě disociace -SH skupiny cysteinu bude hrát významnou úlohu ve změně náboje peptidu při hodnotách pH blízkých pI. Při poklesu pH pod 8,3 by se měl ztratit záporný náboj cysteinu a tím by měl peptid dosáhnout elektroneutrality. 
pI8,3 
Pokud je izoelektrický bod přibližným aritmetickým průměrem pKA neutrální formy, pak bude první uvažovanou disociací deprotonace cysteinu (pK3=8,3) při pH vyšším než pI a druhou reakcí bude protonace koncové skupiny o pKa2=7,9 při pH nižším než pI.
Výsledný izoelektrický bod: pI=8,1.  
 6. disociabilní skupiny v peptidech A a B:
A)	Ser-NH2(9,2), Tyr-OH(10,9), Glu-COOH(4,3), His-NH(6,0), Arg=NH(12,5), Gly-COOH(2,4)
B)	Val-NH2(9,6), Cys-SH(8,3), Glu-COOH(4,3), Lys-NH2(10,8), Gly-COOH(2,4)
    náboje při pH 9: A) Ser1+‑Tyr0‑Ser0‑Met0‑Glu1-‑His0‑Phe0‑Arg1+‑Gly1-   0
                              B) Val1+‑Cys1-‑Phe0‑Glu1-‑Ala0‑Lys1+‑Leu0‑Gln0‑Gly1-  1-
náboje při pH 5: A) Ser1+‑Tyr0‑Ser0‑Met0‑Glu1-‑His1+‑Phe0‑Arg1+‑Gly1-  1+
                           B) Val1+‑Cys0‑Phe0‑Glu1-‑Ala0‑Lys1+‑Leu0‑Gln0‑Gly1-  0
Elektroforézu lze provést např. při pH=5.

 7.  Izoelektrické body: Gly(6,1), Ala(6,1), Glu(3,25) , Lys(10,0), Arg(10,75), Ser(5,65), Asp(2,95), Asn(5,4).
      Aminokyseliny mají v prostředí o vyšším pH než je jejich pI náboj záporný, při nižším pH náboj kladný.
    pH 3: anoda: Asp
              katoda: Arg, Lys, Ala, Gly, Ser, Asn, Glu
              (Glu a Asp mají izoelektrické body jen málo odlišné od 3, budou migrovat menší rychlostí než ostatní aminokyseliny)
    pH 7: anoda: Asp, Glu, Asn, Ser, Gly, Ala
              katoda: Arg, Lys 
              (Gly a Ala budou díky svým izoelektrickým bodům migrovat pomaleji než ostatní aminokyseliny)  
8. 	 Izoelektrické body: Gly(6,1), Ala(6,1), Glu(3,25), Lys(10,0), Arg(10,75), Ser(5,65).
 Při pH=1 se díky svému kladnému náboji zachytí všechny. Při pH=6 se eluují Glu, Ser a také Gly, Ala, neboť jsou téměř v izoelektrickém bodě.
9. 	 Izoelektrické body: Arg(10,75), Ala(6,1), Glu(3,25), Tyr(5,65), Ser(5,65)
     a) pH=11: Arg0, Ala1- , Glu2- , Tyr2- , Ser1- (hodnota náboje určena na základě jednotlivých pKa). Vyteče Arg, ostatní aminokyseliny se zachytí na koloně.
     b) pH=8: Ala1- , Glu1- , Tyr1- , Ser1-. Žádná aminokyselina nevyteče.
10. Izoelektrické body: Glu(3,25), Ala(6,1), His(7,6), Lys(10), Tyr(5,65)
      Pořadí eluce: Glu, Tyr, Ala, His, Lys.
11. 	Izoelektrické body: Cys(5,05), Glu(3,25), Ser(5,65), Ala(6,1), Lys(10,0), His(7,6).
      Nezachytí se Lys, ostatní se zachytí.
12. 	a) disociabilní skupiny peptidu (I): Ala-NH2(9,9), Glu-COOH(4,3), Tyr-OH(10,9), Lys-NH2(10,8), Lys-COOH(2,2)
          disociabilní skupiny peptidu (II): Gly-NH2(9,8), Asp-COOH(3,9), His-NH(6), Tyr-OH(10,9), Lys-NH2(10,8), Lys-COOH(2,2)
          Podstatný rozdíl je v přítomnosti histidinu v peptidu(II) na rozdíl od peptidu(I).
          Pro dosažení kladného náboje histidinu zvolíme např. pH=5:
          Ala1+‑Glu1-‑Gly0‑Tyr0‑Lys0         0                      
          Gly1+‑Asp1-‑His1+-Tyr0‑Lys0       1+ 
          Peptid(II) se na katexu zachytí.                      
      b) disociabilní skupiny peptidu (III): Ser-NH2(9,2), Tyr-OH(10,9), Glu-COOH(4,3), His-NH(6), Arg=NH(12,5), Gly-COOH(2,4)
          disociabilní skupiny peptidu (IV): Val-NH2(9,6), Cys-SH(8,3), Glu-COOH(4,3), Lys-NH2(10,8), Gly-COOH(2,4)
            Nemůžeme využít rozdílu v přítomnosti histidinu ke zvýšení náboje peptidu(III) o +1, neboť potřebujeme dělit anionty. Využijeme rozdílu disociačních konstant OH skupiny tyrosinu a SH skupiny cysteinu. Zvolíme pH=9:
           Ser0-1+-Tyr0-Met0-Glu1--His0-Phe0-Arg1+-Gly1-          -1-0              
           Val1+-Cys1--Phe0-Glu1--Ala0-Lys1+-Leu0-Gln0-Gly1-   -1        
Pokud je pK blízké zvolenému pH, pak je přibližně polovina molekul v disociovaném stavu a druhá polovina v nedisociovaném stavu. Peptid s nábojem -1 až 0 nakonec vyteče, neboť se postupně naprotonují všechny aminoskupiny serinu. Peptid s nábojem -1 se na anexu zachytí.
13. Izoelektrické body: Gly(6,1), Asp(2,95), Tyr(5,65), Ala(6,1), His(7,6), Arg(10,75)
      Pořadí eluce: 1.Asp, 2.Tyr , 3.Ala,Gly, 4.His, 5.Arg
14. 	NH2-Val‑Lys‑Pro‑Gly-COOH, popř. NH2-Val‑Lys‑Gly‑Pro-COOH
15. 	 Po označení  2,4-dinitrofluorbenzenem a úplné hydrolýze získáme ve směsi (Ala+Lys+Glu+Gly) značený alanin a značený lysin, víme také o přítomnosti Glu a Gly. Alanin je tedy na N-konci. Trypsinovou hydrolýzou získáme dva dipeptidy, které rozdělíme iontoměničovou chromatografií při pH=5:
NH2-Ala1+-Lys0-COOH   +1  zachytí se na katexu
NH2-Glu0-Gly1--COOH   -1   vyteče z kolony
Každý z těchto oddělených dipeptidů pak označíme 2,4-dinitrofluorbenzenem a hydrolyzujeme. První peptid poskytne značený alanin a lysin (NH2-Ala-Lys-?-?). Druhý peptid poskytne značenou kyselinu glutamovou. Výsledná sekvence je tedy: Ala-Lys-Glu-Gly.
Určení sekvence peptidu lze rovněž provést v sekvenátoru za použití Edmanova odbourání (fenylisothiokyanátová metoda).
Pro určování primární struktury peptidů lze využít i reakce s LiBH4 (redukce -COOH skupiny na -CH2OH), nebo hydrazinolýzy (všechny aminokyseliny se objeví ve výsledné směsi jako hydrazidy, kromě C-koncové aminokyseliny). 
16. a) merkaptoethanol: B-S-S-C  B-SH + C-SH
      b) N-konce: Asp, Leu
      c) peptid B: ?-?-?-?-Phe-Ala (chymotrypsin)
                         ?-?-Lys-?-Phe-Ala (trypsin)
                         NH2-Leu-?-Lys-Cys-Phe-Ala-COOH (Sangerova metoda)
        d) peptid C: aminokyseliny připadající v úvahu: Asp, Lys(?), Cys (určitě, S-S můstek), Gly(?), Glu(?), Met(?)…jedna z aminokyselin(?) bude součástí peptidu B
                            NH2-Asp-?-?-?-?
                            bromkyan: NH2-Asp-?-?-Met-Glu-COOH
                            trypsin: NH2-Asp-Cys-Lys-Met-Glu-COOH
            peptid B je tedy:
                                         NH2-Leu-Gly-Lys-Cys-Phe-Ala-COOH 
            struktura peptidu P:
		(NH2-Asp-Cys-Lys-Met-Glu-COOH
                  	      		SS
NH2-Leu-Gly-Lys-Cys-Phe-Ala-COOH)

17.  a) cyklický peptid
       b) NH2-Cys-?-?-?-?-?-Tyr-COOH
       c) tripeptid: NH2-Glu-?-Lys-COOH
           tetrapeptid: NH2-Met-Tyr-?-Arg-COOH
           sekvence -Glu-Ala-Lys-Met-Tyr-Cys-Arg-         
18.  thermolysin hydrolyzuje před Leu, Phe, Trp, Tyr, Val
       označení aminokyselin ve štěpech po -merkaptoethanolu:
Asn1-Cys2-Phe3-Thr4-Lys5-Lys6-Trp7-Cys8-Arg9-Ala10-Val11-Cys12
Cys13-Thr14-Pro15-Tyr16-Cys17-Phe18-Pro19-Cys20
A)	NH2-Val11-Cys12-Cys2- Asn1-COOH
B)	NH2-Phe3-Thr4-Lys5-Lys6-COOH
C)	NH2-Trp7-Cys8-Arg9-Ala10-COOH
                     SS
    NH2-Tyr16-Cys17-COOH
D)	NH2-Phe18-Pro19-Cys20-S-S-Cys13-Thr14-Pro15-COOH
 disulfidické můstky mezi: Cys2-Cys12
                                         Cys8-Cys17
                                         Cys13-Cys20

NH2-Asn-Cys-Phe-Thr-Lys-Lys-Trp-Cys-Arg-Ala-Val-Cys-COOH

NH2-Cys-Thr-Pro-Tyr-Cys-Phe-Pro-Cys-COOH

19. N-konec: Thr
      C-konec: Val-Ile-Leu-Lys-COOH
      hydrolýza chymotrypsinem: NH2-Phe-Asp-Val-Ile-Leu-Lys-COOH
      sekvence P: NH2-Thr-Glu-Phe-Asp-Val-Ile-Leu-Lys-COOH
      náboj při pH=6,5: Thr1+-Glu1--Phe0-Asp1--Val0-Ile0-Leu0-Lys0, celkově 1-
      Pokud by byla Glu nahrazena Gln a Asp nahrazena Asn, tak by měl peptid při pH=6,5 náboj 1+, což by nebylo v souladu s podmínkami v zadání úlohy.
20. možné úseky -šroubovice označeny silně:
       ‑ Leu‑Ala‑His‑Thr‑Tyr‑Gly‑Pro‑Phe‑Glu‑Ala‑Ala‑Met‑Cys‑His‑
       ‑Glu‑Glu‑Asp‑Pro‑Asp‑Gly‑Met‑Gly‑Cys‑Ala‑Phe‑His‑
      při poklesu pH pod disociační konstanty karboxylových kyselin:
       ‑ Leu‑Ala‑His‑Thr‑Tyr‑Gly‑Pro‑Phe‑Glu‑Ala‑Ala‑Met‑Cys‑His‑
       ‑Glu‑Glu‑Asp‑Pro‑Asp‑Gly‑Met‑Gly‑Cys‑Ala‑Phe‑His‑
Přesné určení sekundární struktury bílkoviny je úkolem pro počítačové modelování.
21. NH2-Ala-Ala-Lys-Ala-Ala-Ala-Phe-COOH
22. Protein má poměrně hodně hydrofobních skupin, díky kterým může dobře kotvit v cytoplasmatické membráně. K určení sekundární struktury by mohla být využita statistická metoda P.Choua a G.Fasmana (1974). Prvním krokem je simultánní hledání "zárodků" tvorby - a -struktur. Tvoří je úseky (penta- až hexapeptidy) obsahující minimálně čtyři (u -struktur tři) zbytky s velkou tendencí tvořit příslušný typ pravidelné sekundární struktury. Největší snahu tvořit -helix mají methionin, glutamát, leucin a alanin, v -strukturách se vyskytují hlavně valin, isoleucin, fenylalanin a tyrosin. V dalším kroku se "zárodky" rozšiřují na obě strany, dokud průměrný sklon tetrapeptidu k vytváření -, resp. -struktury neklesne pod kritickou hodnotu. Posléze se vyhledají oblasti protisměrných ohybů, obsahující především glycin a prolin.
Silně vyznačený úsek bude mít tendenci tvořit -helix: 
Met-Ala-(Leu-Phe-Ala)3-(Leu-Met-Phe)3-Pro-Ans-Gly-Met-Leu-Phe
Při nahrazení Leu zbytkem Asp se sníží hydrofobnost proteinu, zřejmě se také sníží schopnost tvořit -helix.
23. b,c,d
24. a) -šroubovice: 153.0,15 = 22,95nm = 23nm
          -skládaný list: 153.0,36= 55,08nm = 55,1nm
      b) a+b=153
          a.0,15+b.0,36=42nm
          a=62 zbytků tvoří -šroubovici
          b=91 zbytků tvoří -skládaný list
25.  počet aminokyselin=(0,2.109nm)/0,15nm= 1,3333.109
       rychlost syntézy=1,3333.109/(365.24.3600)=42,3 zbytků/sec
26.  hmotnost ribozomálních proteinů=25000.(4/3)..(9.10-7cm)3.1g/cm3.0,4 = 3,0536.10-14g
       délka -šroubovice=(3,0536.10-14/120).6,023.1023.0,36=5,5176.107nm=0,055m
       délka jednoho ovinutí=.1=3,1416m=3141,6nm
       počet ovinutí=5,5176.107/3141,6=1,76.104 krát
27.	V=.0,72.280=431,027nm3=4,3103.10-19cm3
m=3.1000.120/(6,023.1023)=5,9771.10-19g
=m/V=5,9771.10-19g/4,3103.10-19cm3=1,39 g/cm3
28.	a)7, b)1, c)3, d)2

B.
1d
2b
3d
5.  1‑O‑methylglukosa;1,2,3,4,6‑penta‑O‑methylgalaktosa;
    2,3,4,6‑tetra‑O‑methylgalaktosa
6. glucitol, kys. mannonová, kys. mannarová
7. 2,3,4,6‑tetra‑O‑methylgalaktosa, 2,3,6‑tri‑O‑methylglukosa
9. 	2,4,6-tri-O-methyl -D-glukosa, 2,3,4,6-tetra-O-methyl-D-mannosa
10. 	2,3,4-tri-O-methyl-D-glukosa, 2,3,4,6-tetra-O-methyl-D-galaktosa
11. 	5-O-galaktosyl-D-ribosa
12. 	4-O-galaktosyl-D-fruktofuranosa
      D-glukopyranosyl-D-mannopyranosid uronát
13. 	1,4,6-tri-O-methyl-D-fruktosa, 2,3,4,6-tetra-O-methylmannosa

C
1.b)estery
2.d)
4. Pro disociaci první volné –OH skupiny fosfolipidu platí pKa=6,8, pokud je přítomna i poslední –OH skupina v disociovatelné formě, odpovídá její disociační konstanta pK3=12,3.
     a)1-, b)0, c) 0, d) 1-, e) 2-, f) 2-, g) 1-
6. 	pH 5: a)O, b)1+, c)1+, d)0, e)0, f)0, g)0. 
     pH 8: a)1‑, b)0, c)0, d)1-, e)2-,f)2‑,g)1‑.
7. 	a)1-palmitoyl-2-oleylfosfatidylcholin+tetrabutylamonium hydroxid= glycerolfosfocholin
        glycerolfosfocholin+2 palmitoylchlorid= dipalmitoylfosfatidylcholin
     b) 1-palmitoyl-2-oleylfosfatidylcholin+fosfolipáza A2= 1-palmitoylfosfatidylcholin
          1-palmitoylfosfatidylcholin+ stearoylchlorid=1-palmitoyl-2-stearoylfosfatidylcholin
     c)1-palmitoyl-2-oleylfosfatidylcholin+ tetrabutylamonium hydroxid= glycerolfosfocholin
         glycerolfosfocholin+ stearoylchlorid=distearoylfosfatidylcholin
         distearoylfosfatidylcholin+ fosfolipáza D=distearoylfosfatidová kyselina
         distearoylfosfatidová kyselina+ethanolamin=distearoylfosfatidylethanolamin
D
2. 	 A260=[AMP]  260(AMP) + [GMP]  260(GMP)
     A280=[AMP]  280(AMP) + [GMP]  280(GMP)
     [GMP]=3,07.10-5 mol/l, [AMP]=1,90.10-5 mol/l
4. RNA 321, DNA 309
5. a/ UpCpUpApGpA
    b/ Up+ CpUpApGpAp, Up+Cp+UpApGpAp, Up+Cp+Up+ApGpAp atd.
    c/ UpCpUpApG+pAp, UpCpUpA+pG+pAp, UpCpU+pA+pG+pAp atd.
    d/ UpCpUpA+pGpAp
    e/ UpCpU+pA+pG+pAp
6.  fosfodiesteráza hadího jedu: 32pApCpTpTpA+pG, 32pApCpTpT+pA+pG,  32pApCpT+pT+pA+pG, 32pApC+pT+pT+pA+pG (poslední dinukleotid nechá nerozštěpený)
     desoxyribonukleáza II: 32pAp+CpTpTpApG, 32pApCp+TpTpApG, 32pApCpTp+TpApG, 32pApCpTpTp+ApG, 32pApCpTpTpAp+G a další
8. 	a) pC…je na volném 3´ konci RNA
b) pankreatická ribonukleáza rozštěpí polynukleotid (psáno od 5´konce k 3´konci) za U a C
možnosti: ACAGUC
                ACGAUC
                GAUACC
                AGUACC
c) A bude na začátku
    možnosti: AGCAUC…vyřazeno z důvodů b)
                    ACGAUC
                    AGCACU…nesplňuje podmínku a)
                    ACGACU…nesplňuje podmínku a)
         řešení:(pApCpGpApUpC)
8. (-ATAGGCTTAGTACCA-)
9. -TCGCATC-,  -UCGCAUC-
10. a/ GATCAA   palindrom:GATC
          CTAGTT                    CTAG
      b/ TGGAAC   palindrom není
          ACCTTG
      c/ GAATTC    celé palindrom
          CTTAAG
      d/ ACGCGT    celé palindrom
          TGCGCA
      e/ CGGCCG   celé palindrom
          GCCGGC
       f/ TACCAT     palindrom není
          ATGGTA
11. 617,5; 1,82.106 Da, 3,02.10-18 g
12. a) 1,43.1011 Da
      b) 2,32.108 pb, 0,079 m
13. 67,2% G+C, 32,8% A + T, molární poměr purinových a pyrimidinových bazí je 1:1, molární složení: 33,6 % G, 33,6% C, 16,4% A, 16,4% T
14. PheLeu, AlaThr, IleLeu, ProSer-
15. a) 8500 pb 
      b) rozdíl v molekulové hmotnosti je 5,25.106 Da, což je 8,72.10-18 g
      c) 2833 kodonů a tedy aminokyselin, což je 3,97.105 Da
16. 100 řetězců, průměrná délka 300 bazí (za předpokladu, že polymerace proběhne v obou  pokusech stejně)
17. TTC GAA pro Phe a Glu,  
      TTT GAG ATC TTG GAG CGG CGG nebo TTT GAG ATC TTA GAG CGG CGG
18. a)jednoduchá šroubovice
      b)G 19%, T 25%, A 33%, C 23%
      c)G 21%, T 29%, A 29%, C 21%
      d)nový řetězec DNA
19. frekvence kodonů:
      UUU     0,9.0,9.0,9= 72,9%  Phe
      UUC     0,9.0,9.0,1= 8,1%    Phe
      UCU                         8,1%    Ser
      CUU                         8,1%    Leu 
      UCC                         0,9%    Ser
      CUC                         0,9%    Leu
      CCU                         0,9%    Pro
      CCC                         0,1%    Pro
 Po součtu dostáváváme teoretické aminokyselinové složení shodné s experimentálním.
20.	frekvence kodonů:
GGG                     12,5%    Gly
GAA                      12,5%    Glu
       AGA                      12,5%    Arg
       AAG                      12,5%    Lys
       GGA                      12,5%    Gly
       GAG                      12,5%    Glu
       AGG                      12,5%    Arg
       AAA                       12,5%    Lys
       Syntezovaný polypeptid bude obsahovat 25% glutamátu.
21.	strukturní gen: 750 nukleotidů (+ iniciační a terminační kodony)
serin je v aktivním centru

E
1. +7,55 kJ/mol, ‑2,85 kJ/mol
2. a) ‑30,5 kJ/mol, b) ‑47,6 kJ/mol, c) ‑53,3 kJ/mol
3. ‑25,7 kJ/mol, 7,2.105 mol/l
4. 3,5 mmol/l
5. +31,3 kJ/mol, 3,08.104
6. +0,8 kJ/mol, ‑32,6 kJ/mol
Hydrolýza difosfátu usnadňuje průběh reakce zleva doprava, posunuje rovnováhu směrem k produktům. 
7. +8,4 kJ/mol, 0,034, +4,41 kJ/mol
8. G0=12,5 kJ/mol, 6,42.10‑3
9. G0= -9,6 kJ/mol, 1,04.10‑3
10. 	G0(1)=-29,25 kJ/mol, G0=-8,35 kJ/mol, G=-232 J/mol
Glykosidovou vazbu sacharosy lze dle standartní volné energie hydrolýzy považovat za makroergickou vazbu, ale sacharosa se nepovažuje za makroergickou sloučeninu. G0(1)= -16,3 kJ/mol
      G0=G0(3)+G0(2)-G0(1)-G0(4)= -1,7 kJ/mol
      G(4)= -44,25 kJ/mol
11. 	G0(1)= -1,7 kJ/mol
      G0+G0(2)= -G0(1)+G0(3)+G0(4)
      G0= -16,3 kJ/mol
12. 	+7,3 kJ/mol reakce nebude probíhat samovolně
13. 	a) 0 kJ/mol
  b)+2 kJ/mol, G= -11,1 kJ/mol

F
1b
2. 	a-oxidoredutasa
       triviálně malátdehydrogenasa 
       systematicky malát :NAD+-oxidoreduktasa (u reakcí s NADH jako donerem, či     NAD+ jako akceptorem se upřednostňuje systematický název donor:NAD+-oxidoreduktasa, a ne NADH:akceptor-oxidoreduktasa) 
     b-transferasa
        triviálně alaninaminotransferasa
        systematicky L-alanin:2-oxoglutarát-aminotransferasa
        jiný název glutamát-pyruvát transaminasa
     c-hydrolasa
        triviálně exoamylasa nebo -amylasa
        systematicky 1,4--D-glukan-maltohydrolasa
        jiné názvy glykogenasa nebo sacharogenamylasa
     d- oxidoreduktasa
         triviálně methanoldehydrogenasa
         systematicky methanol:NAD+-oxidoreduktasa
         jiný název formaldehydreduktasa 
     e-transferasa
        triviálně hexokinasa
        systematicky ATP:fruktosa-fosfotransferasa
     f-hydrolasa
       triviálně ureasa
       systematicky močovina-amidohydrolasa
g-izomerasa
   triviálně fosfoglukomutasa
   systematicky -D-glukosa-1,6-fosfomutasa
   jiný název glukosafosfomutasa
h-ligasa (syntetasa)
   triviálně D-alanin-D-alanin ligasa
   systematicky D-alanin:D-alanin-ligasa (tvořící ADP)
   jiný název D-alanylalanin syntetasa
3. 	                                             holoenzym

                        kofaktor                                       apoenzym

    ionty kovů                 koenzym        

                 kosubstrát                     prosthetická skupina
    (podléhá cyklické regeneraci)
    Jako prostetické skupiny se označují pevně vázané stabilní nepeptidové složky bílkovin.  Koenzym nemusí být k enzymu pevně vázán. Pyridoxalfosfát je nepostradatelný při transaminaci a dekarboxylaci aminokyselin. Koenzym A je přenašečem acylů při oxidačním odbouráváním mastných kyselin, oxidační dekarboxylaci 2-oxokyselin a při acetylacích.
4. 	glukokinasa: v=1,510-6[S]/([S]+1010-3)
hexokinasa: v=0,110-6[S]/([S]+0,110-3)
    mol.min-1: a) 0,015, 0,05; b) 0,136, 0,0909; c) 0,50, 0,098; d) 1,125, 0,0997
    Hexokinasa je při nízkých koncentracích glukosy mnohem výkonnější než glukokinasa, což jí umožňuje zásobovat mozek glukosa-6-fosfátem pro anaerobní glykolýzu i při poklesu hladiny glukosy v krvi. Tím je mozek chráněn proti náhlému nedostatku energie. Glukokinasa v játrech se podílí na regulaci glukosy v krvi tím, že ji při vysokých koncentracích intenzivně převádí na glukosa-6-fosfát jako výchozí sloučeninu pro syntézu glykogenu.
5. 	mol.min-1: a) 0,00488; b) 0,197; c) 0,00762
6. 	Km=(k-1+k2)/k1=(105+102)/109=1,00110-4moll-1=100,1moll-1
V=k2[Et]=1020,1=10nmoll-1s-1
číslo přeměny: k2=V/[Et]=100s-1
v=V[S]/([S]+Km)=1,665nmoll-1s-1
7. 	rovnice přímky při vynesení 1/v0 proti 1/S: y=210-7x+0,0224
rovnice přímky při vynesení S/v0 proti S: y=0,0222x+210-7
    9,00910-6 mol/l, 45,045 mol.min-1
8. 	a) nekompetitivní inhibice 
         rovnice přímky ze závislosti 1/v0 na 1/S: y=610-7x+0,0568
         rovnice přímky ze závislosti S/v0 na S: y=0,0568x+610-7
                                                                         610-7=Km/V(1+i/Ki)
                                                                         0,0568=1/V(1+i/Ki)
         pro hodnotu V=45,045 mol.min-1 vychází Ki=6,4.10-6 mol.l-1
 b) kompetitivní inhibice
      rovnice přímky ze závislosti 1/v0 na 1/S: y=710-7x+0,0224
      rovnice přímky ze závislosti S/v0 na S: y=0,0224x+710-7
                                                                         710-7=Km/V(1+i/Ki)
                                                                         0,0224=1/V
  pro hodnotu Km=9,00910-6 moll-1 je Ki=8,110-4 moll-1
9. 	 kompetitivní inhibice, lze ji zrušit přebytkem substrátu
     rovnice přímek ze závislosti 1/v0 na 1/S: y=10-5x+0,00211 (bez inhibitoru)
                                                                     y=210-5x+0,00199 (s inhibitorem)
      rovnice přímek ze závislosti S/v0 na S:  y=0,00203x+10-5 (bez inhibitoru)
                                                                     y=0,00195x+210-5 (s inhibitorem)
                                                                         210-5=Km/V(1+i/Ki)
                                                                         10-5=Km/V
                                                                                                  Ki=6 mmol.l-1
                                                                         0,00203=1/V     V=492,6 nkat
                                                                         při použití ostatních možných hodnot 1/V (0,00211; 0,00199; 0,00195) vyjde průměrné V=495 nkat
                                                                          Km =4,95 mmol.l-1
10. 	inhibice kompetitivní
      rovnice přímek ze závislosti 1/v0 na 1/S: y=0,00200x+1,67667 (bez inhibitoru)
                                                                     y=0,00510x+1,56814 (s inhibitorem)
      rovnice přímek ze závislosti S/v0 na S:  y=1,70712x+0,00199 (bez inhibitoru)
                                                                     y=1,63716x+0,00507 (s inhibitorem)
      Km=1,17 mmol.l-1, V=0,586 mmol.min-1, Ki = 0,66 mmol.l-1
11. 	inhibice nekompetitivní
      rovnice přímek ze závislosti 1/v0 na 1/S: y=0,00854x+10,00101 (bez inhibitoru)
                                                                      y=0,02032x+23,16440 (s inhibitorem)
      rovnice přímek ze závislosti S/v0 na S:   y=10,02169x+0,00852 (bez inhibitoru)
                                                                  y=23,17397x+0,02031 (s inhibitorem)
      Km = 0,85 mmol.l-1, V = 0,100 mol.min-1, Ki = 7,59 mol.l-1
12. 	rovnice přímky ze závislosti S/v0 na S:   y=0,104993x+0,000185, r=0,993
      Km = 1,76mmol.l-1, V = 9,52nkat, vi = 3,66nkat
13. 	a)0,0049mol.min-1 
      b)0,1970mol.min-1
      c)0,1320mol.min-1
14. 	látkové množství enzymu: 6,2510-13mol
  aktivita=6,2510-132500=1,56nkat=0,0936mol.min-1
15. 	látkové množství enzymu: 2,083310-12mol 
 číslo přeměny=2010-6/(602,083310-12)=160 000 s-1
16. 	%ES=(1,5nkat/5nkat)100=30%
17. 	K=([NADH][oxalacetát][H+])/([NAD+][jablečnan])
  výsledné koncentrace složek v systému:
  [jablečnan]=0,01mmol.l-1
  [oxalacetát]=0,09mmol.l-1
[NADH]=0,09mmol.l-1
[NAD+]=4,91mmol.l-1
Dosazením do výše uvedené rovnice získáme hodnotu [H+]=3,030910-12mol.l-1.
Pro průběh reakce je nutno zvolit pufr o pH=11,5.