Látkové složení Esenciální AMK * Rostliny + mikroorganismy 0 * Člověk -- biosyntéza -12 esenciální - 8 Lys, Try, Phe, Met, Thr, Ile, Leu, Val, Arg? Titrační křivka Thalidomid Thalidomid L AMK - CO-R-N Diastomery threoninu Ninhydrinová reakce RP HPLC AMK Proinzulín 84 AMK Inzulín -- 51 AMK Amanita phalloides Microcystiny Microcystiny Srpkovitá anémie Srpkovitá anémie MS MS-MS MS-MS MS-MS á - helix â - sheet â - turn Strukturní motivy Strukturní domény Hemoglobin Rtg difrakce Denaturace - renaturace Chaperony Titrační křivka Izolace proteinů Literatura * Scopes : Protein Purification * Harris : Protein Purification Methods -- Practical Approach * Deutcher : Guide to Protein Purification * Janson : Protein Purification * Kastner : Protein Liqiud Chromatography Metody separace proteinů * Vychází z klasických metod chemické analýzy * Uplatňují se zde i speciální metody Problémy se vzorkem * Komplexnost * Malá množství * Labilita Plánování separace bílkovin Cíl izolace * Získání homogenní bílkoviny * Zachování biologické aktivity * Čistota Závěr : získat vzorek o patřičné čistotě s vynaložením patřičného úsilí Volba vstupního materiálu * Preparát z daného organismu * Preparát s největším obsahem dané bílkoviny * Preparát s nejmenším obsahem nečistot Sledování průběhu separace Stanovení koncentrace bílkoviny Kjeldahlova metoda -- stanovení N2 * Mineralizace vzorku -- převedení organického dusíku na NH4+ * Stanovení NH4+ - titrace, fotometrie, selektivní elektrody UV spektrofotometrie * 280 nm -- aromatické AMK interference nukleotidů * 180 - 230 nm -- peptidická vazba Výhody - nedestruktivní metoda - není třeba kalibrace VIS spektrofotometrie Přídavek činidla barevný derivát * Destruktivní metoda * Nutná kalibrační závislost Biuretová metoda Princip : Cu2+ vytváří v alkalickém prostředí komplex se 4 N peptidické vazby Cu2+ Měření : 540 -- 560 nm 310 nm Folinova metoda Princip : hydroxyfenolová skupina tyrosinu redukuje fosfomolybdenany na molybdenovou modř Měření : 725 nm Lowryho metoda Princip : kombinace Folinovy a Biuretové metody Měření : 600 nm Metoda dle Bradfordové Princip : při vazbě Coomassie Brilliant Blue G 250 na bílkovinu dochází k posunu absorpčního maxima z 465 na 595 nm. Meření : 595 nm Nejčastěji používané metody Stanovení biologické aktivity Enzymatické,imunologické, toxické, hormonální receptorové atdf. Vlastní separace Obecné schéma Vstupní materiál Mikroorganismy Bakterie, kvasinky, plísně, řasy Výhody - lze jej snadno získat v dostatečné množství - selekce mutantů o požadovaných vlastnostech - genetické inženýrství - termofilní organismy Bezobratlí Hmyz, plži, mlži Nevýhody - málo se používá, nesnadno se získává Živočišné tkáně * Laboratorní zvířata -- myši, krysy, králíci * Jateční zvířata -- orgány * Člověk -- tělní tekutiny Rostlinné tkáně Špenát, řepa, hrách Nevýhoda -- problematický růst za definovaných podmínek Rozbití a extrakce Bakterie * Záleží na lokalizaci Balotina Princip -- jemné skleněné kuličky přidány do bakteriální suspenze a rychle třepány nebo míchámy -- nutno chladit French (X) press Princip -- zmražená bakteriální suspenze protlačována malým otvorem, přičemž dochází k rekrystalizaci a rozrušení buněk Ultrazvuk Princip -- ultrazvuk (> 20 kHz) v roztoku vyvolává střižní síly -- nutno chladit Lysozym + osmotický šok (mírný osmotický šok) Princip -- lysozym rozruší buněčnou stěnu, následně je bakteriální suspenze zředěna destilovanou H2O -- bakterie popraskají Živočišné tkáně * Třecí miska s pískem * Ruční homogenizatory -- Potter -- Elvehjemův * Mixery * Osmotická lyse - erytrocyty Rostlinné tkáně * Rozrušení buněčné stěny pomocí celulas, * Obsahují hodně fenolických látek, které mohou být oxidovány na chinony -- melaniny, které mohou modifikovat bílkoviny Srážecí metody Srážení * Nezaměňovat s denaturací -- bílkoviny zůstávají v nativním stavu * První metody používané pro separaci bílkovin -- EtOH, (NH4)2SO4 * Filtrace nahrazena centrifugací Rozpustnost bílkoviny * Vlastnostmi bílkoviny -- distribuce hydrofobních a hydrofilních skupin na povrchu bílkoviny Rozpustnost bílkoviny * Vlastnostmi roztoku -- pH, iontová síla, org. rozpouštědla, org. polymery, teplota Izoelektrická precipitace Srážení neutrálními solemi Vsolování Vysolování (NH4)2SO4 * Rozpustnost se málo mění s teplotou * Saturovaný roztok 4 M - hustota 1,235g/cm3 umožňuje centrifugaci agregovaných bílkovin (hustota 1,29 g/cm3) * Levný * Stabilizuje bílkoviny * Relativně čistý Srážení - dvojstupňově Srážení org.rozpouštědly mísitelnými s vodou * Rozpouštědla ruší solvatační obal bílkoviny Srážení org.rozpouštědly mísitelnými s vodou * COHN -- separace plazmatických bílkovin EtOH * Nutno provádět při T < 0 oC, při větší teplotě dochází k denaturaci * Dvojstupňově * Přídavky z tabulky nebo podle vzorce Srážení selektivní denaturací * Při této metodě denaturujeme balastní bílkoviny, cílová bílkovina musí zůstat z 85 - 90 % v nativním stavu. * Denaturační vlivy -- T, pH, org. rozpouštědla * Bílkovina musí nejen denaturovat i precipitovat Tepelná denaturace Chromatografické metody Chromatografie * Cvet -- separace chlorofylů na Al2O3 1903 Chromatografie Zařízení pro LPC Ionexová chromatografie Ionexy * Katexy - - vazba kationtů silné - sulfo(S), sulfopropyl(SP) OSO3- slabé - karboxy(C), karboxymetyl(CM) COO- * Anexy - + vazba aniontů silné - dietylaminoetyl(DEAE) slabé -- trietylaminoetyl(TEAE) Ionexová chromatografie * Nanášení vzorku -- nízká iontová síla * Eluce -- gradientová * Zvyšováním iontové síly * Změnou pH * Afinitní eluce Použití -- purifikace, zakoncentrování, výměna pufru Hydrofobní chromatografie * Stacionární fáze -- - C8, -fenyl * Mobilní fáze -- vodné roztoky 1.7 M (NH4)2SO4 * Eluce -- snižováním iontové síly Použití : purifikace bílkovin Afinitní chromatografie Afinitní páry Afinitní chromatografie nanesení vzorku Afinitní chromatografie vznik interakce Afinitní chromatografie vymytí balastů Afinitní chromatografie eluce Provedení * Nanesení vzorku -- nízká iontová síla * Eluce -- selektivní - volným ligandem -- neselektivní - změna pH, iontové síly, polarity Použítí : analytické (stanovení K), purifikace Gelová permeační chromatografie Gelová permeační chromatografie Gelová permeační chromatografie Gelová permeační chromatografie * Nanášení vzorku -- objem vzorku < 2% objemu kolony * Eluce -- izokratická Použití : stanovení Mr, odsolování, purifikace Elektromigrační metody Podstata "Pohyb elektricky nabitých částic v elektrickém poli" Zónová elektroforéza Upořádání Upořádání Polyakrylamid Složení -- kopolymer akrylamidu a N,N,- methylenbisakrylamidu + plně splňuje požadavky - Monomery jsou neurotoxiny !!!!!! Použití : analýza bílkovin Polyakrylamid SDS PAGE SDS PAGE Stanovení Mr pomocí SDS PAGE Stanovení Mr pomocí SDS PAGE - standardy Izoelektrická fokusace "Elektroforéza v gradientu pH, částice jsou separováný podle svých pI" Izoelektrická fokusace Izoelektrická fokusace Izoelektrická fokusace analytická * Provedení - v gelech -- PAGE, agarosa * Použití - sledování komplexních směsí - izoenzymové složení - stanovení pI -- rozřezání a eluce -- pH elektrody -- pI standardy Izoelektrická fokusace analytická Dvojrozměrná elektroforéza Dvojrozměrná elektroforéza Kolagen v kůži á - keratin á -- keratin - vlas â - keratin â - keratin