02b-Chromatografie

   

   

       1. Enzym se vyskytuje jako monomer a tetramer. Jak získáte monomer zbavený tetrameru?

   

       

       2. Připravujete hybridní DNA renaturací směsi dentaurované DNA. Jak ji oddělíte od zbytků
   nerenaturované DNA?

   

       

       3. Máme směs kruhové a lineární DNA o stejné M[r] = 6.10^6. Která bude vytékat z kolony
   agarosy dříve a proč?. Jak by to bylo v případě nativní a denaturované rRNA?

   

       

       4. Čistíte enzym pomocí standartní metody zahrnující GPC. Použijete-li 10x vyšší
   koncentraci enzymu než je uvedeno, začne enzym vytékat při V[0]. Proč?

    

   

       5. Chcete zvýžit množství materiálu zpracovávaného sloupcovou chromatografií. Je vhodné
   zvětšit délku nebo šířku kolony nebo obojí?

    

   

       6. Papírová chromatografie látek A, B, C a D dala hodnoty R[f] v následujících soustavách:

   

             Látka                 BuOH-H[2]O                 IPrOH-HCl                 EtOH    
             HAc

               A                         0,23                            0,31     
                      0,42                 0,09

               B                         0,24                            0,20     
                      0,51                 0,62

               C                         0,38                            0,58     
                      0,40                 0,64

               D                        0,41                            0,56     
                      0,53                 0,10

     

    Jak nejlépe oddělíte tyto látky?

   

       

       7. Aplikovali jste 20 mg bílkovin na sloupec DEAE-celulosy, z nich 30% je hledaný
   enzym.Poeluci jste nalezli ve všech frakcích dohromady 18,9 mg bílkovin, ale žádnou enzymovou
   aktivitu. Vysvětlete!

       

   

       8. DNA o M[r] 6.10^6 je tvořena dvouvláknovým úsekem a jednovláknovým prodloužením o
   stejné délce jako dvouvlákno.  Chromatografujete ji na hydroxylapatitu gradienetem fosfátu,
   kdy je eluce téměř nezávislá na M[r]. Kde se dá očekávat tato DNA - při V[R] jednovláknových
   nebo dvouvláknových DNA nebo mezi nimi? Proč?

   

       

       9. Enzym vyžaduje Mg^2+, jeho ztráta způsobuje ireversibilní inaktivaci. Pokusili jste se
   ho purifikovat na iontoměniči i GPC, v obou případech ztratil aktivitu. Vysvětlete, co se
   stalo a jak upravíte postup, aby k inaktivaci nedošlo!

   

       

       10. Některé látky, např. morfin, se váží na specifické receptory nervových buněk. Jak to
   využijete k isolaci tohoto  receptoru?

   

       

       11. Dva enzymy o stejné M[r] mají při pH 5,5 uspořádanou sek. strukturu, nejméně 75% je
   alfa-helix. Při pH 8,5 jeden z nich ztrácí uspořádanost a nabývá tvaru náhodného klubka,
   tato    změna je vratná. Navrhněte separační postup včetně analýzy  isolovaného materiálu!