Řezové preparáty Barvení histologické a histochemické Řezy ruční ­ žiletka, břitva, ruční mikrotom Řezy připravené mikrotomem Schéma příprav mikroskopických preparátů montáž do vody ruční řezy fixace projasňování macerace montáž do proj. média barvení roztlak montáž do barviva kryo řezy parafínové řezy polotenké řezy fixace fixacefixace kryoprotekce zmrazení řezání: zmrazovací mikrotom, kryostat barvení montáž do média mísitelného s vodou dehydratace dehydratace převádění do parafínu řezání: mikrotom řotační šáňkový barveníbarvení odparafínování dehydratacedehydratace montáž do média nemísitelného s vodou žehlení a lepení prosycení monomerem polymerizace řezání: mikrotom rotační ultramikrotom Ruční mikrotom Fixace * zachování buněk a pletiv ve stavu co nejbližšímu k živému stavu * snížení strukturálních změn a změn chemického složení * strukturální proteiny a jiné sloučeniny se musí změnit na nerozpustné ve všech reagenciích, se kterými přijdou v průběhu celého procesu do styku * perfektní fixace = jen teoretická Fixace * fyzikální ­ vysoká teplota - koagulace bílkovin, tání tuků ­ chladová ­ ,,freeze drying" ­ ,,freeze substitution" * chemická ­ fixativa koagulující - koagulace cytoplazmatických proteinů ničí strukturu organel (např. mitochondrie) ­ fixativa nekoagulující - zachovávají organely (pro EM) Fixační směsi ­ FAA (FPA) Formaldehyde-Acetic (Propionic) acid ­ Aethanol * 50% nebo 70% ethanol 90 ml * ledová kyselina octová 5 ml * 37 ­ 40% formaldehyd 5 ml fixáž koagulující stálá rychle proniká pro anatomické účely Obecný postup parafínové metody * Odběr materiálu - segmenty * Fixace segmentů * Dehydratace (etanolová řada vzestupná) * Prosycení rozpouštědlem parafínu (xylén) * Prosycení parafínem * Zalití do parafínu * Krájení, žehlení a lepení parafínových řezů * Rozpuštění parafínu na řezech (xylén) * Rehydratace řezů (etanolová řada sestupná) * Barvení řezů * Dehydratace nabarvených řezů * Montáž (uzavírání řezů) do média nemísitelného s vodou (kanadský balzám, Eukitt, Entelan, DPX) Zalévání do parafínu dehydratace převádění do parafínu zalévání do parafínu Braune et al. 1982 parafínový bloček chlazení Příprava bločku ke krájení dělení bloku parafínu trimování bločku parafínu přitavení bločku parafínu na dřevěný špalík izolovaný bloček parafínu Krájení parafínových řezů Braune et al. 1982 rozdělení na bločky krájení řezů lepení bločku na špalík lepení řezů Mikrotomy sáňkový mikrotom Reichert rotační mikrotom Leitz Skleněné a porcelánové kyvety s víčkem Hellendahl Coplin Schiefferdecker Dóza s držákem skel na 6 skel Sada plastových kyvet na barvení skla v držáku se přenášejí z jedné lázně do druhé najednou Barva barva - vjem světla podle jeho kvality () purpurová 700 nm červená 650 nm oranžová 600 nm žlutá 550 nm zelená 500 nm modrá 450 nm fialová 400 nm průchodem světla přes barevné preparáty dochází k absorpci světla komplementární barvy Barvivo * ne všechny barevné sloučeniny mohou být barvivem * barvivo = barevná sloučenina, která může být navázána na substrát * barvivo histologické - barví různé složky pletiv, používá se na základě empirických znalostí, chemismus reakce často není známý * histochemické barvení - barvící proces je vysoce specifický, je známá jeho chemická podstata Teorie barevnosti * chromoforová: chromofor ­ má charakteristické uspořádání atomů, které je zodpovědné za za absopci světla v určité části spektra, auxochrom ­ část molekuly, která zodpovídá za vazbu na substrát * kyselé radikály: -OH, -COOH, -SO3H anionická barviva * bazické radikály: -NH2 kationická barviva * chinoidní struktury ­el. páru ˇ přírodní karmín - červec nopálový orcein -lišejníky (Lecanora, Roccella) hematoxylin - dřevo kampešky (Haematoxylon campechianum) brasilin - dřevo druhů rodu Caesalpinia (Caesalpinia sappan, C. brasiliensis) indigo - Indigofera tinctoria, Isatis tinctoria juglon - listy, kořeny, kůra Juglandaceae * syntetická Dělení barviv podle původu Hematoxylin a hematein hematoxylin = sloučenina tmavě modrofialové barvy ze dřeva Haematoxylon campechianum Používá se s mořidly - nejčastěji Fe3+ nebo Al3+ Natural Black 1 nebo C.I. 75290 barví teprve jeho oxidovaná forma = hematein lze barvit regresivní i progresivní metodou ­ záleží na formě aplikace mořidla Podélný parafínový řez semenem sněženky Galanthus nivalis L. regresivní barvení Heidenheinovým železitým hematoxylinem optimální diferenciace = v jádech buněk embrya i endospermu jsou patrná 3+ endosperm embryo osemení (testa) suspenzor Parafínový řez poupětem máku, Papaver somniferum Delafieldův hematoxilin, progresivní barvení, Al3+ jako mořidlo kanadský balzám Indigo Indigofera tinctoria Isatis tinctoria dnes již vyráběné synteticky pro vlastní barvení řezů se nepoužívá, ale v histochemii jsou často používány tzv. indigogenní metody Kryostat mikrotom pro přípravu řezů zmrazených objektů Kryostatový řez listem tabáku tloušťka řezu 30m Indigogenní metoda detekce aktivity -glukosidasy se substituovaným indoxyl glukosidem jako substrátem Dělení barviv podle chromoforů * nitrobarviva (trinitrofenol) -NO2 * azobarviva (oranž G, Bismarkova hněď, Sudan IV, Fast Blue B...) -N=N* fenylmetanová barviva = arylmetanová (p-rosanilin, fuchsin, Magenta, genciánová violeť, Fast green) * chinolinová barviva (indofenol, aziny) * xanthenová barviva (fluorescein, eosin, Giemza = azureosinát, rhodamin) * ftalocyaninová (alcianová modř) ˇ Barvení progresivní: barvíme do žádané intenzity zbarvení (Mayerův nebo Delafieldův hematoxylin) * Barvení regresivní: preparát přebarvujeme a pak postupně odbarvujeme (diferencujeme), podle afinity struktur k barvivu se některé odbarví zcela, jiné zůstanou zbarvené (Heidenheinův železitý hematoxylin, safranin) Druhy a způsoby barvení podle výsledku a aplikace ˇ barvení simultánní: směs barviv v jednom roztoku (složky nesmějí spolu reagovat) (Alexander) * barvení sukcedánní (sukcesivní): dvě barviva po sobě, doplňují se barevné tóny, každé barvivo barví jiné struktury (alcianová modř - pravá jaderná červeň, safranin - Fast Green, bazický fuchsin - pikroindigo karmín /Cajal - Brožkova metoda/) Druhy a způsoby barvení podle výsledku a aplikace ˇ barvení substantivní: barvení samotným barvivem ve vodném nebo etanolovém roztoku * barvení adjektivní: použití mořidel (soli kovů = kamence, tanin), barvení adjektivní přímé = směs barviva a mořidla (Ehrlichův, Mayerův, Delafieldův hematoxylin), barvení adjektivní nepřímé = nejprve řezy moříme a pak barvíme (Heideheinův železitý hematoxylin) Druhy a způsoby barvení podle výsledku a aplikace Postup při podvojném sukcesivním barvení: alcianová modř - jaderná červeň stálá (Kernechtrot, nuclear fast red) 1. odparafínování řezů (xylen) 2. převedení řezů do vody 3. vlastní barvení: a) 3% roztok kyseliny octové 10 min. b) barvení buněčných stěn - 1% alcianová modř v 1% kyselině octové 10 min. c) opláchnutí 3% kyselinou octovou d) praní v tekoucí vodě 10 min. e) barvení buněčných jader - 0,1% jaderná červeň stálá v 5% roztoku Al2 (SO4 )3 , 5 - 15 min. 4. opláchnutí destilovanou vodou 5. odvodnění alkoholovou řadou 6. převod do xylenu 7. uzavření do Eukittu Podvojné barvení sukcedánní: alcianová modř - pravá jaderná červeň parafínový řez listem kosatce Iris sp. tloušťka řezu 15m Podvojné barvení sukcedánní: alcianová modř - pravá jaderná červeň příčný řez stonkem nocenky Mirabilis jalapa 12 m Klíční rostlina Arabidopsis podvojné barvení Safranin - Fast green 2 dny 7 dní podélné parafínové řezy tloušťka řezu 8 m DIC Olympus BX-61 regresivní barvení safraninem správná diferenciace slabá diferenciace Odkazy na zajímavé stránky Univerzita v Bristolu ­ metody histologického barvení http://www.bristol.ac.uk/vetpath/cpl/histmeth.htm stránky kurzu Botanická mikrotechnika UK Praha (A.Soukup, O.Votrubová) http://kfrserver.natur.cuni.cz/studium/prednasky/mikro/prep/tprep.htm metody histologie a imunohistochemie http://www.ihcworld.com/antibody_staining.htm protokoly barvení pro pletiva zalitá v pryskyřici Energy Beam Sciences http://www.ebsciences.com/staining/orcein.htm encyklopedie http://cs.wikipedia.org/wiki/Barven%C3%AD_(biologie) http://encyklopedie.seznam.cz/search/?s=barven%C3%AD&source=3 fixace a protokoly základních barvení http://www.nottingham.ac.uk/pathology/default.html http://stainsfile.info/StainsFile/jindex.html