Kvantitativní hodnocení mikrobiálních kultur Stanovení počtu životaschopných buněk plotnovou metodou Úvod: Jaký je rozdíl mezi přímým a nepřímým stanovením počtu buněk? Proč je v našem případě nutno promíchat zásobní vzorek? Jak poznáme kontaminaci ředícího roztoku? Proč se neroztírá kupříkladu mililitr ředění? Teoretická část: Zjišťování počtu mikroorganizmů je nutné při některých biochemických a genetických experimentech. Pro stanovení množství buněk mikroorganizmů v různých prostředích byla vypracována řada metod, pro daný účel se volí metoda nejlépe vyhovující. Stanovení počtu mikroorganizmů se provádí v daném objemu a přepočítává obvykle na 1 ml původního vzorku. Těmito výsledky jsou pak korigovány získané výsledky experimentů. Počet mikrobiálních buněk (CFU) se stanovuje v daném objemu (1 ml původního vzorku). K čemu se využívá: - sledování přírustku buněk, pokud během kultivace v tekutém mediu odebíráme reprezentativní vzorek - při hodnocení podílu jednotlivých skupin bakterií v celkovém zastoupení - k poskytnutí obrazu o fyziologickém stavu buněk, prospívání Používané metody: Ø přímé mikroskopické (počítání samotných buněk v preparátu ze vzorku, bez kultivace. Výhoda: rychlost, získáme však počet živých i mrtvých buněk. Ø nepřímé kultivační – kultivací části vzorku zjistíme počet životaschopných buněk počítáním kolonií na agarových plotnách, dále pak stanovení počtu buněk nefelometricky na základě intenzity světla odraženého od buněk (stanovení optické denzity – kalibrační křivka a počet buněk pak z lineární části); nákladnější, časově náročnější Přímé stanovení počtu buněk: - počítání v preparátu: potřeba suspenze o vhodné hustotě buněk - preparáty: nezbarvené (pozorování fázovým kontrastem) nebo barvené - počítací komůrky: Thomova, Bürkerova; je to silné podložní sklíčko s vyrytou sítí čtverečků a krycího skla. Krycí sklo se pokládá na lišty, takže vzniká mezi sklíčky prostor se známým objemem. Buňky se po napipetování usadí na dně. - Počítáme z asi 80ti políček komůrka - Nemáme – li komůrku, počítáme na podložním skle počet buněk z urč.objemu (Př: program Lucia) a přepočítáme na celkový - K odlišení živých a mrtvých buněk: vitální test (barvivo nabarví jen mrtvé buňky) – stanoví se pak procento mrtvých buněk v suspenzi - Nebo počítání buněk v barveném preparátu (známe objem preparátu, fixujeme jej, barvíme, počítáme např.v deseti polích, vynásobíme počtem polí celého preparátu) Nepřímé stanovení počtu buněk – kultivace životaschopných - proč se vyřeďuje postupně? Aby se zabránilo rozbití buněk osmotickým šokem - hustota suspenze, ze kterého se pipetuje prvních 0,1 ml: 0 -10^3 buněk/ml je bez opalescence, 10^5 buněk/ml^ lehce opaleskuje, 10^7 až 10^9 tvoří mléčný zákal dle velikosti a tvaru buněk Stanovení buněčné hmoty: - přímé metody: váha sušiny: i mrtvé buňky! stanovení obsahu N, bílkovin v buněčné hmotě - nepřímé: turbidimetrické stanovení buněčné hmoty (zákal) Materiál: Ø Sterilní bakteriologické plotny s MPA (medium M2) Ø Sterilní zkumavky Ø Sterilní pipety Ø Sterilní hokejky Ø Sterilní fosfátový pufr (roztok R16) nebo fyziologický roztok (R1) Bakteriální kmen: Postup: 2) ředění kultury: - do sady sterilních zkumavek rozpipetujeme po 0,9 ml sterilního roztoku (R1 nebo R16) - ze vzorku s kulturou odebereme 0,1ml suspenze a přeneseme do 1. zkumavky - mícháme vždy čistou pipetou; nejprve obsah první zkumavky s výsledným objemem 1 ml (pufr + 0,1 ml bakt.vzorku) - z rozmíchaného roztoku v první zkumavce odebereme 0,1 ml a přeneseme do další zkumavky - další sterilní pipetou se promíchá obsah druhé zkumavky a 0,1 ml se opět přenese do 3. zkumavky. Takto se pokračuje sž do konečného ředění - VŠECHNY KROKY ŘEDĚNÍ SE PROVÁDÍ STERILNÍMI POMůCKAMI 3) Očkování - očkujeme na předem popsané plotny s MPA - z každé zkumavky s ředěním 10^-5 až 10^-7očkujeme objem 0,1 ml suspenze na 1 misku, vždy alespoň dvě nebo tři misky od každého ředění - napipetovaný objem se roztírá sterilní hokejkou krouživým pohybem po celém povrchu agaru; dnemmisky se otáčí proti pohybu roztírání a na hokejku se netlačí - při pipetování a roztírání otevíráme misky co nejméně - kultivujeme dnem vzhůru 2-3 dny (pro cvičení 7 dní)/30°C 4) Kontrola sterility ředícího roztoku: - ze zásobního R1 nebo R16 odebereme dvakrát 0,1 ml na dvě misky a rozetřeme hokejkou, kultivujeme s současně Nákres: Hodnocení: K hodnocení vybereme nejvhodnější ředění (použijeme to ředění, kde se vyskytuje 20-200 kolonií na misce) a spočítáme počet kolonií na všech třech miskách tohoto ředění. Kolonie počítáme ze dna misky, kde jdou také vidět, a to proto, že si je můžeme označit fixou na sklo tečkou. Ze tří získaných hodnot vypočítáme průměr, číslo vynásobíme ředěním a hodnotou 10 (= desetina pipetovaného mililitru, abychom získali hodnotu pro mililitr celý). Získaný údaj je hodnota CFU (colony forming units, což je počet bakterií schopných tvořit jednu kolonii, tedy počet buněk v objemu 1 ml). Průměrný počet buněk x hodnota ředění (kladný index)^ x 10 = CFU Př: Průměrný počet kolonií ze tří misek je 75. Použité ředění, ze kterého se nejlépe počítalo, bylo 10^-5. CFU = 75 . 10^5. 10 = 7,5 . 10^7 ^ Tabulka počtu kolonií ze tří ředění: Počet kolonií Ředění Miska 1 Miska 2 Miska 3 10^-5 10^-6 10^-7 Průměr: CFU = Závěr: Bylo naočkováno x misek s ředěním: , od každého ředění tedy x misek. Misky byly kultivovány 7 dní při 30 °C. Při odečítání výsledků (počtu kolonií) se jevilo nejvýhodnější ředění x, kterým se po zprůměrování počtu zjistilo CFU ve vzorku a to s hodnotou: