Kvantitativní hodnocení mikrobiálních kultur
Stanovení počtu životaschopných buněk plotnovou metodou
Úvod:
Jaký je rozdíl mezi přímým a nepřímým stanovením počtu buněk? Proč je v našem případě nutno
promíchat zásobní vzorek? Jak poznáme kontaminaci ředícího roztoku? Proč se neroztírá kupříkladu
mililitr ředění?
Teoretická část:
Zjišťování počtu mikroorganizmů je nutné při některých biochemických a genetických experimentech.
Pro stanovení množství buněk mikroorganizmů v různých prostředích byla vypracována řada metod, pro
daný účel se volí metoda nejlépe vyhovující. Stanovení počtu mikroorganizmů se provádí v daném
objemu a přepočítává obvykle na 1 ml původního vzorku. Těmito výsledky jsou pak korigovány získané
výsledky experimentů.
Počet mikrobiálních buněk (CFU) se stanovuje v daném objemu (1 ml původního vzorku). K čemu se
využívá:
- sledování přírustku buněk, pokud během kultivace v tekutém mediu odebíráme
reprezentativní vzorek
- při hodnocení podílu jednotlivých skupin bakterií v celkovém zastoupení
- k poskytnutí obrazu o fyziologickém stavu buněk, prospívání
Používané metody:
Ø přímé mikroskopické (počítání samotných buněk v preparátu ze vzorku, bez kultivace. Výhoda:
rychlost, získáme však počet živých i mrtvých buněk.
Ø nepřímé kultivační – kultivací části vzorku zjistíme počet životaschopných buněk počítáním
kolonií na agarových plotnách, dále pak stanovení počtu buněk nefelometricky na základě intenzity
světla odraženého od buněk (stanovení optické denzity – kalibrační křivka a počet buněk pak
z lineární části); nákladnější, časově náročnější
Přímé stanovení počtu buněk:
- počítání v preparátu: potřeba suspenze o vhodné hustotě buněk
- preparáty: nezbarvené (pozorování fázovým kontrastem) nebo barvené
- počítací komůrky: Thomova, Bürkerova; je to silné podložní sklíčko s vyrytou sítí
čtverečků a krycího skla. Krycí sklo se pokládá na lišty, takže vzniká mezi sklíčky prostor se
známým objemem. Buňky se po napipetování usadí na dně.
- Počítáme z asi 80ti políček
komůrka
- Nemáme – li komůrku, počítáme na podložním skle počet buněk z urč.objemu (Př: program
Lucia) a přepočítáme na celkový
- K odlišení živých a mrtvých buněk: vitální test (barvivo nabarví jen mrtvé buňky) –
stanoví se pak procento mrtvých buněk v suspenzi
- Nebo počítání buněk v barveném preparátu (známe objem preparátu, fixujeme jej, barvíme,
počítáme např.v deseti polích, vynásobíme počtem polí celého preparátu)
Nepřímé stanovení počtu buněk – kultivace životaschopných
- proč se vyřeďuje postupně? Aby se zabránilo rozbití buněk osmotickým šokem
- hustota suspenze, ze kterého se pipetuje prvních 0,1 ml: 0 -10^3 buněk/ml je bez
opalescence, 10^5 buněk/ml^ lehce opaleskuje, 10^7 až 10^9 tvoří mléčný zákal dle velikosti a
tvaru buněk
Stanovení buněčné hmoty:
- přímé metody: váha sušiny: i mrtvé buňky!
stanovení obsahu N, bílkovin v buněčné hmotě
- nepřímé: turbidimetrické stanovení buněčné hmoty (zákal)
Materiál:
Ø Sterilní bakteriologické plotny s MPA (medium M2)
Ø Sterilní zkumavky
Ø Sterilní pipety
Ø Sterilní hokejky
Ø Sterilní fosfátový pufr (roztok R16) nebo fyziologický roztok (R1)
Bakteriální kmen:
Postup:
2) ředění kultury:
- do sady sterilních zkumavek rozpipetujeme po 0,9 ml sterilního roztoku (R1 nebo R16)
- ze vzorku s kulturou odebereme 0,1ml suspenze a přeneseme do 1. zkumavky
- mícháme vždy čistou pipetou; nejprve obsah první zkumavky s výsledným objemem 1 ml (pufr
+ 0,1 ml bakt.vzorku)
- z rozmíchaného roztoku v první zkumavce odebereme 0,1 ml a přeneseme do další zkumavky
- další sterilní pipetou se promíchá obsah druhé zkumavky a 0,1 ml se opět přenese do 3.
zkumavky. Takto se pokračuje sž do konečného ředění
- VŠECHNY KROKY ŘEDĚNÍ SE PROVÁDÍ STERILNÍMI POMůCKAMI
3) Očkování
- očkujeme na předem popsané plotny s MPA
- z každé zkumavky s ředěním 10^-5 až 10^-7očkujeme objem 0,1 ml suspenze na 1 misku, vždy
alespoň dvě nebo tři misky od každého ředění
- napipetovaný objem se roztírá sterilní hokejkou krouživým pohybem po celém povrchu
agaru; dnemmisky se otáčí proti pohybu roztírání a na hokejku se netlačí
- při pipetování a roztírání otevíráme misky co nejméně
- kultivujeme dnem vzhůru 2-3 dny (pro cvičení 7 dní)/30°C
4) Kontrola sterility ředícího roztoku:
- ze zásobního R1 nebo R16 odebereme dvakrát 0,1 ml na dvě misky a rozetřeme hokejkou,
kultivujeme s současně
Nákres:
Hodnocení:
K hodnocení vybereme nejvhodnější ředění (použijeme to ředění, kde se vyskytuje 20-200
kolonií na misce) a spočítáme počet kolonií na všech třech miskách tohoto ředění. Kolonie počítáme
ze dna misky, kde jdou také vidět, a to proto, že si je můžeme označit fixou na sklo tečkou.
Ze tří získaných hodnot vypočítáme průměr, číslo vynásobíme ředěním a hodnotou 10 (= desetina
pipetovaného mililitru, abychom získali hodnotu pro mililitr celý).
Získaný údaj je hodnota CFU (colony forming units, což je počet bakterií schopných tvořit jednu
kolonii, tedy počet buněk v objemu 1 ml).
Průměrný počet buněk x hodnota ředění (kladný index)^ x 10 = CFU
Př:
Průměrný počet kolonií ze tří misek je 75. Použité ředění, ze kterého se nejlépe počítalo, bylo
10^-5.
CFU = 75 . 10^5. 10 = 7,5 . 10^7
^
Tabulka počtu kolonií ze tří ředění:
Počet kolonií
Ředění
Miska 1
Miska 2
Miska 3
10^-5
10^-6
10^-7
Průměr:
CFU =
Závěr:
Bylo naočkováno x misek s ředěním: , od každého ředění tedy x misek. Misky byly
kultivovány 7 dní při 30 °C. Při odečítání výsledků (počtu kolonií) se jevilo nejvýhodnější ředění
x, kterým se po zprůměrování počtu zjistilo CFU ve vzorku a to s hodnotou: