Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

                                               ELISA



•         Biochemická metoda

•         Detekce protilátky (Ab) nebo antigenu (Ag)

                                               ELISA

•        1. IMUNOLOGICKÁ REAKCE

              Ag + Ab → IK

•        2. POVRCH (imobilizace Ag a Ab)

                                     Medium Binding Polystyren

•         nemodifikovaný polystyren (hydrofóbní) – vazba biomolekul pouze pasivní interakcí

•         Imobilizace velkých molekul – biomolekuly s velkou hydrofóbní oblastí reagující s
povrchem (>20 kDa)



                                        Aminated Polystyren

•         Modifikovaný polystyren s pozitivně nabitými aminovými skupinami – NENÍ hydrofóbní (pouze
iontový charakter)

•         Vazba malých, negativně nabitých molekul nebo molekul s aminovými, karboxylovými nebo
thiolovými funkčními skupinami

•         Imobilizace molekul rozpuštěných v detergentech (Triton X-100, Tween 20)

                                   Základní složky systému ELISA

Imunosorbční povrch (pevná fáze):

•         používá se upravený polystyrén ve formě mikrotitračních destiček, kuliček, hřebenů,
pruhů. Důležitá je vhodná polymerizační teplota a délka polymerizace. Při přehnaně vysokých
sorpčních vlastnostech by docházelo k navázání nežádoucích látek, a tím ke snížení citlivosti a
specifity reakce. Nízké sorpční vlastnosti by nezabezpečovaly dostatečně souvislý a stabilní
imunosorpční povrch (nestabilita a nespolehlivost systému vede ke snížení citlivosti a
reprodukovatelnosti).



Konjugát:

•         specifická Ab (mono- nebo polyklonální) navázaná na enzym tak, aby nebyla porušena
původní schopnost Ab vázat se na Ag. Lze použít enzym, který po reakci se substrátem vytváří v
přítomnosti vhodného chromogenu dostatečně intenzivní reakci (nejvhodnější enzymy: HRP – křenová
peroxidáza a ALP)

                                         Vlastnosti enzymů

•         Malá reaktivní hmotnost

•         Vysoká stabilita a enzymová aktivita

•         Kovalentní vazba na Ab a Ag

•         Produkt enzymové reakce musí být barevný či jinak detekovatelný



Substrát:

•         Při použití konjugátu s HRP jako chromogen slouží ortofenylén-diamin hydrochlorid = OPD,
který v přítomnosti peroxidu vodíku jako substrátu (katalyzátoru) vyvolá barevnou reakci.



                                            TYPY ELISA

•       NEPŘÍMÁ ELISA PRO Ag (kompetitivní)

Ag se naváže na tuhou fázi a reakční prostor se promyje. Pokud je Ag malý, naváže se předem na
větší nosič (napři. BSA)

Zkoumaný roztok, ve kterém se předpokládá přítomnost Ag, se míchá se specificky značenou Ab a směs
se inkubuje s imobilizovaným Ag

Inkubace, promytí a přidání substrátu, čímž se vyvolá barevná reakce



-určuje množství Ag ve zkoumaném vzorku – o vazbová místa Ab soutěží Ag ve zkoumaném vzorku (volný)
a Ag imobilizovaný. Čím víc Ag bude ve vzorku, tím méně Ab se může navázat na imobilizovaný Ag a
tím menší barevná intenzita bude v reakčním roztoku. Nejvíce zbarvený roztok bude v kontrolní
jamce, kde reakční směs neobsahovala volný Ag.









•        SENDVIČOVÁ ELISA PRO Ag

Na tuhou fázi se naváže Ab

Na ni se potom navazuje známé nebo neznámé množství Ag a promyje se to. Přidá se enzymem značená
volná Ab, která reaguje s volnými Ag imobilizovanými vazbou do komplexu s Ab. Přidá se substrát na
detekci enzymové aktivity.

Z naměřených hodnost standardních vzorků se sestrojí kalibrační křivka, podle které se vyhodnotí
vzorky s neznámou koncentrací zkoumaného Ag.

- Je nezbytně nutné, aby obě Ab měly stejnou specifitu a Ag musí mít nejméně 2 determinanty,
protože s ním reagují 2 molekuly Ab



•       KOMPETITIVNÍ ELISA PRO Ag A HAPTENY – STANOVENÍ Ag

Na tuhou látku se naváže Ab specifická pro Ag, který se má stanovit. Pak se přidá známé množství
enzymem značeného Ag (AgE) a buď známé množství nebo analyzované množství neoznačeného Ag. V
průběhu inkubabce soutěží značený AgE s neoznačeným Ag a po promytí zůstávají jen Ag vázané na Ab.
Pak se přidá substrát, který rozloží enzym přítomný v IK za vniku barevného produktu.



-intenzita zbarvení roztoku s produktem enzymové reakce  se měří spektrofotometricky. Sestrojí se
kalibrační křivka z hodnot známého množství Ag a určí se podle ní koncentrace analyzovaného Ag ve
vzorku.

-použití: kvanitativní stanovení nízkomolekulárních látek (hormonů, proteinů, léků)



•       SENDVIČOVÁ ELISA PRO Ab = NEPŘÍMÁ ELISA PRO DETEKCI Ab

Ag se naváže na tuhou fázi a promyje. Přidá se zředěné sérum, ve kterém se má určit přítomnost Ab.
Následuje inkubace a promytí, dochází při tom k navázání na imobilizované Ag. Přidá se enzymem
značená sekundární Ab (AbE) a promyje se to. Přidá se substrát a změří se intenzita barevné reakce.



-slouží na důkaz specifických Ab (IgG a IgM) pro určitý Ag.

                                         Praktické cvičení

                                             Protokol:

•         Zpracování výsledků:

Sestrojit kalibrační křivku – rovnici kalibrační křivky a hodnotu spolehlivosti

Vypočítat koncentraci IL-6 z rovnice kalibrační křivky pro každý vzorek

Sestrojit graf

Závěr