Moderní metody buněčné biologie
Western blotting
SDS-PAGE a Western blotting
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=books
Western blotting ­ přenos na membránu:
Membrány:
* PVDF
* nitrocelulóza
Western blotting ­ imunodetekce:
Postup imunodetekce
* Blokování membrány
Membrána je blokována, abychom zabránili nespecifickým interakcím mezi membránou a
protilátkou. K tomuto účelu lze použít roztok hovězího sérového albuminu (BSA) nebo
ředěné odtučněné mléko (non-fat dry milk - NFDM).
* Inkubace s primární protilátkou
Membrána je inkubována s primární protilátkou specifickou pro daný protein. Protilátka
je ředěna v pufru (PBS nebo TBS), který obsahuje nosič (BSA nebo NFDM) spolu s
detergentem. Optimální koncentrace protilátky je zjišťována využitím různých ředění.
Western blotting je používán pro
detekci vybraného proteinu ve vzorku
(komplexní směsi proteinů) pomocí
polyklonálních nebo monoklonálních
protilátek specifických pro daný
protein, či určitý typ posttranslační
modifikace.
ˇ Inkubace se sekundární protilátkou
Po opláchnutí membrány (s cílem odstranit nenavázanou primární protilátku) je membrána
inkubována se značenou sekundární protilátkou specificky rozpoznávající daný typ
primární protilátky. Sekundární protilátka je většinou značena enzymem který produkuje,
po reakci se substrátem, barevný produkt, fluorescenci či světlo.
* Detekce
Po odmytí sekundární protilátky, je membána inkubována se substrátem specifickým pro
daný typ enzymu. V případě chemiluminiscnční detekce je emitované světlo detekováno
pomocí rentgenových filmů. Výsledné ,,pruhy" jsou hodnoceny kvalitativně nebo
kvantitativně (denzitografie; pomocí kamer snímajícíh přímo chemiluminiscenční reakci).
1. Towbin H., Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from
polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.Proc Natl
Acad Sci U S A. 1979 Sep;76(9):4350-4
2. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature. 1970 Aug 15;227(5259):680-5.
3. Burnette WN. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium
dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic
detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 1981 Apr;112(2):195-
203
Western blotting ­ hodnocení:
denzitogram
loading control
studovaný protein
Podrobný popis a další literatura:
* Molecular Biology of The Cell (s.469-580),
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=books
* Principles and Techniques of Practical
Biochemistry
http://www.westernblotting.org/