Několik praktických rad pro hodnocení Morfologických a cytologických znaků * pomáhají IDENTIFIKACI (rod i druh, př: plísně, mikrokoky - pigment) * pomáhají při kontrole kontaminace kultury (posuzujeme dvě či více odlišných kolonií) * pomáhají posouzení fyziologického stavu kultury - makroskopické morfologické znaky: popis kolonií - mikroskopické cytologické znaky – jen mikroskopické (vnitřní struktury, i preparace: fixace, barvení..); nativní preparát (pozorování fázovým kontrastem) barvené preparáty (zviditelní morfologii buňky a jejích struktur: Gramovo, Ziehl Nielsenovo, barvení struktur – spor, inkluzí..) Makroskopické a mikroskopické znaky se hodnotí pospolu! 1) Morfologie – makroskopické znaky Bakteriální druh – vzhled kolonie ovlivněn - typem živné půdy!! (př:E. coli na MHC či Endově) - stářím kultury Popis kolonií větš. na základních mediích: MPB, MPA; kvasinky, plísně – sladina. Posouzení růstu na misce vždy doplňte mikroskopií. a) charakter růstu v tekuté půdě – statická kultivace * difúzní zákal – v celém objemu media, aerobní buňky * hrubé vločky – také aerobní; Staphylococcus, některé bacily (dáno buněčnou stěnou, shlukováním buněk) * sedliny – fakultativně anaerobní či anaerobní – Lactobacillus, kvasinky * blanka – znamená špatnou smáčivost buněk či mycelia a držení vrstvičky silou povrchového napětí (před kultivací přidané povrchově aktivní látky tenzidy by tedy způsobily ponoření blanky; neionogenní tenzidy – neinhibující množení buněk – způsobí difúzní růst blankotvorných buněk); vyskytuje se u buněk tvořících většinou drsné vrásčité kolonie, aerobních; vzhled kožovitý (plísně), suchý vrásčitý křís (oxidativní kvasinky); u stárnoucí kultury blanka sedá!! (možná záměna se sedlinou) Pozn.: „mázdra“ = povrchový útvar sedlinotvorných kvasinek, které kvašením vyčerpaly sacharidy a počaly aerobně využívat vlastní vyprodukovaný ethanol. Kultivace v tekutém mediu může probíhat i na třepačce – lepší distribuce živin a kyslíku – pak tedy nehodnotíme charakter růstu b) charakter růstu na šikmém agaru Jak postupovat, abychom na šikmý agar naočkovali kulturu nejvhodněji pro pozorování charakteru růstu (Pozn: na šikmém agaru nehodnotíme jednotlivé kolonie, pouze okraje hádka; pracujeme s čistou kulturou – pro kontrolu čistoty je ale potřeba souběžně naočkovat křížový roztěr): Pracujeme s předsušeným agarem (kondenzační voda by mohla rozrušit pravidelný nárůst buněk!!) (Zde rozdíl oproti uchovávání buněk na šikmém agaru, kdy je naopak kondenzační voda žádoucí pro dostatečnou vlhkost.) Očkujte nejlépe: jehlou (ne kličkou – příliš široká, naberete mnoho buněk) rovná čára. Kultivace: 24 - 48h (kvasinky 2-3 dny) Takto můžeme posoudit: rychlost růstu, tvar nátěru: rovný plný, bodový, ostnitý, rhizoidní; profil nátěru – plochý, vypouklý); povrch nátěru – lesklý, drsný, suchý; konzistenci; pigmenty; exopigmenty - porovnejte rozdíl c) Popis kolonie bakteriálního druhu na agaru Petriho misky Kolonie je klon buněk narostlý z jednotlivé buňky očkovaného kmene. Zjišťujeme: viz příloha „Morfologie kolonií“. Nerovnosti růstu – způsobeny stářím kolonie. Mukoidní (M) charakter růstu – vlhké slizovité a velmi lesklé kolonie tvořené opouzdřenými buňkami (Azotobacter, Leuconostoc). Hladké (S) kolonie – rovný okraj s nebo bez lesku u neopouzdřených b. Drsné (R) kolonie – suché s nerovnými okraji, liší se výškou vrásnění, rostou tak buňky tvořící řetízky, mycelia či pseudomycelia (Bacillus; kvasinky Pichia, Hansenula, Candida; Trichosporon). Změny M – S – R jsou důsledkem mutací. Př: infekční materál – většinou M-kmeny; po několika přeočkováních mutace v S-kmeny. Z nich M-forma zpátky těžko získatelná! Mohou mít R genotypy hladké kolonie??: - Fenotyp S, M a R ovlivněn složením media. Př: přítomnost 1) 20% zkvasitelných sacharidů podporuje S a M typy, R typy jsou na něm hladší. 2) Tenzidy způsobují hladké až lesklé fenotypy R typů. d) Obrovské kolonie kvasinek a plísní Kvasinky se očkují na vyšší vrstvu sladiny kapkou suspenze mladších buněk ve fyziologickém roztoku přeneseného očkovací kličkou. Papily = vznik a pomnožení některých mutantů. Sektory – genetická nejednotnost, sporulace. e) Růst ve vpichu šikmého agaru MPA (u bakterií) Určuje nároky MO na kyslík: aerobní MO rostou v horní části vpichu, anaerobní u dna a FANA po celé délce vpichu. Jaké je stáří očkované kultury? Inokulum je 24h bujonová kultura. 2) Morfologie a cytologie – mikroskopické znaky * hodnotí se TVAR, VELIKOST a USPOŘÁDÁNÍ buněk, přítomnost zvláštních „orgánů“ na buňce, způsob rozmnožování viditelný v preparátu * bakterie vykazující růstové cykly mají v každém z cyklů jinou morfologii buněk či jiné složení buněčné stěny - tedy jiné imunologické vlastnosti Jakou podobu může mít mikroskopický preparát, který pod mikroskopem hodnotíme?? - klasické podložní sklíčko, na kterém provádíme diferencovné barvení buněk samotných, či jejich složek, či rozlišujeme živé a mrtvé buňky u vitálního testu (barvení netoxickými barvivy obarví buňku mrtvou, která se již nebrání přijetí barviva..); pro úplnost můžeme dodat, že preparát na podložním sklíčku je při barvení buněk většinou fixován (v plameni) - u nativního preparátu (pozorování suspenze) na podložní sklíčko přikládáme krycí sklíčko - při pozorování plísní, kvasinek či aktinomycet pozorujeme sklíčkové kultury (krycí sklíčko je vytaženo z agaru, ve kterém bylo během kultivace zapíchnuto pod úhlem 45˚a je tudíž kulturou porostlé - hodnotí se pak na něm najednou substrátové i vzdušné mycelium) nebo kultury narostlé na celofánu (některé kultury prorůstají medium, jsou těžko pro pozorování odejmutelné, na celofánu se s nimi snadno manipuluje). Zdroje: Šilhánková, Demnerová (1993): Návody pro laboratoře z mikrobiologie, VŠCHT, Praha http://vydavatelstvi.vscht.cz/knihy/uid_es-006/index.html http://biomikro.vscht.cz/sylaby/biochmikrorg.htm Zkratky: b. - buňka, bakterie, MO – mikroorganismus, MPA – masopeptonový agar, MPB – masopeptonový bujon, FANA – fakultativně anaerobní