Myš

•             savec

•             z toho plyne, že embryonální vývoj je ze všech modelů nejpodobnější člověku

•             genom sekvenován

•             jedinečný díky možnostem genetických manipulací (transgenní myši)

                   Myš je velmi relevantní model pro studium lidské embryologie

                                          Myš - nevýhody

•             relativně dlouhý generační čas

•             embrya obtížně přístupná experimentální manipulaci – pouze v děloze matky

•             finančně náročný model

                                          Transgenní myš

                                  Příprava myších kmenových buněk

                                Transgenní myš – state of the art:

•           knock-in myši – umožňují záměny genů, vnesení bodových mutací atd.

•           kondicionální knock-out/in myši založené na Cre-recombinázovém systému

a) pouze v určité tkáni/typu buněk

b) pouze po vnější stimulaci (tzv. inducibilní Cre), tj. v experimentálně určeném čase

c) náhodně – v určitém procentu buněk, využití pro lineage tracing

                                    Kondiciovaná genová exprese

•            Změna genomu – „zapnutí/vypnutí“ genu

•            Transaktivace transkripce, rekombinace DNA

•            Řada biologických procesů



                                     Binární transgenní systém

•            Dříve – krátké sekvence transgenu s ovlivnitelným promotorem

–       Ovlivnění: těžké kovy, teplotní šoky, interferony, steroidy

•            Krátké sekvence: pleiotropní efekty, vysoká bazální aktivita bez přítomnosti induktoru



                                     Binární transgenní systém

•            Binární systém – efektor + transgen









                                 Místně specifická rekombinace DNA

                               Princip místně specifické rekombinace

•             Umlčení nebo aktivace genové exprese



•             Exprese Cre nebo Flp rekombinázy (které katalyzují rekombinaci mezi příslušnými
rozpoznávacími místy)



•             Odstranění fragmentů DNA, které jsou obklopeny přímými repeticemi (loxP nebo FRT)

                            Tkáňově specifické vypínání genů (knockout)

•             Výhodou je, že můžeme obejít letální fenotyp a také podrobně zkoumat biologické
procesy



•             Postup:

–         Produkce myší, u kterých je gen zájmu obklopen místy loxP

–         Linie myší, které exprimují Cre jen v určitých tkáních

–         Křížením vznikne potomstvo, kde je gen našeho zájmu inaktivován jen v buňkách, které
exprimují Cre

–         Ke správné interpretaci fenotypu je třeba vědět, ve kterých buňkách došlo k rekombinaci-
užití reportéru



•             Hypomorfní alela







Aktivace genů katalyzovaná Cre

•             K aktivaci dojde

–         Odstraněním STOP DNA (která zabraňovala transkripci daného genu

–         Obnovením ORF (který byl přerušen nějakou sekvencí)

Časová regulace exprese Cre



                                               Závěr

•            Kontrola exprese dvou a více genů ve stejné myši

•            Změna ne jen na úrovni DNA a RNA, ale i na úrovni proteinu