Kapalinová chromatografie - LC
•   Fyzikálně-chemická metoda dělení kapalin (roztoků) využívající rozdělování složky mezi dvě nestejnorodé fáze, nepohyblivou (stacionární) a pohyblivou (mobilní), přičemž pohyblivou fází je kapalina.
-  DIFUSNÍ KOEFICIENTY O 5 ŘÁDŮ MENŠÍ NEŽ V GC
•  malý vliv molekulární difuse, velký význam odporu proti přenosu hmoty v mobilní fázi, PROBLÉM TURBULENCÍ MOBILNÍ FÁZE
•  GIDDINGSOVA TEORIE
•   LLCaLSC, dáleGPCJEC
• TECHNIKY SLOUPCOVÉ CHROMATOGRAFIE
-  systém otevřený - nízkotlaký
- Low (Medium) Pressure Liquid Chromatography
-  systém uzavřený - vysokotlaký
- High Performance Liquid Chromatography
8017
Kapalinová chromatografie
• TEORIE LLC (kapalinová rozdělovači)
- kapalná mobilní i stacionární fáze (zakotvená na tuhém nosiči)
- OBĚ KAPALINY NEMÍSITELNÉ
*  obtížné splnit
- řešení CHEMICKY VÁZANÉ stacionární fáze
*  poměr objemů VJVS posunut ve prospěch mobilní fáze
- pro retenci látek
■ NUTNÁ ODLIŠNÁ POLARITA OBOU FÁZÍ
*  CHEMICKY VÁZANÉ stacionární fáze
- obvykle NEPOLÁRNÍ
-MOBILNÍ FÁZE-POLÁRNÍ
»tzv. OBRÁCENÉ FÁZE („reversed-phase")
Kapalinová chromatografie
STACIONÁRNÍ FÁZE pro LLC - chemicky vázaná stacionární fáze - nosič - SILIKAGEL
• PORÉZNÍ ČÁSTICE NEPRAVIDELNÉHO TVARU
• PORÉZNÍ ČÁSTICE KULOVITÉHO TVARU
-  komerčně dostupné silikagely s definovanou velikostí částic
•  SILANOLOVÉ SKUPINY - Si-OH NA POVRCHU ČÁSTIC
- REAKCE S MODIFIKÁTOREM
» např. OKTADECYLTRICHLORSILAN
•  AMINOPROPYLOVÉ SKUPINY - (CH2)3-NH2 NA POVRCHU
ČÁSTIC
- REAKCE S MODIFIKÁTOREM - TVORBA AMIDŮ
Kapalinová chromatografie
• STACIONÁRNÍ FÁZE pro LLC
-  chemicky vázaná stacionární fáze - nosič - SILIKAGEL
*  odstranění zbylých -OH skupin trimethylsilylovými skupinami
*  funkční modifikace sorbentu
- uhlovodíkové skupiny (řetězce) - oktadecyl, fenyl, oktyl atp.
- nitrily -C=N, dioly, aminy
- účelové modifikace sorbentu - makrocyklické látky, opticky aktivní látky atp.
-  makroporézní gely organických látek - uhlovodíků
*  funkční skupiny přímo na matrici gelu
94
Kapalinová chromatografie
• MOBILNÍ FÁZE pro LLC - v RP-LLC - obvykle polární
•  ALKOHOLY - methanol, ethanol, propanol, isopropanol
•  NITRILY - acetonitril
•  ETHERY - tetrahydrofuran, dioxan, diethylether
- mnohdy ve směsi s vodou, směsi i více rozpouštědel
•  ŘADA DLE ELUČNÍ SÍLY
- větší eluční síla A kratší retenční časy
- voda - methanol - acetonitril - tetrahydrofuran - aceton
•  VHODNÁ NÍZKÁ VISKOSITA
•  VHODNÁ TRANSPARENTNOST V UV OBLASTI
Kapalinová chromatografie
• SEPAROVANÉ SLOŽKY v LLC
-  na nepolárních stacionárních fázích - nejvíce zadržovány
n-ALKANY
• RETENCE ROSTE SE STOUPAJÍCÍ MOLEKULOVOU HMOTNOSTÍ
-  méně zadržovány
- AROMÁTY, HALOGENOVANÉ UHLOVODÍKY
- ještě méně zadržovány (v řadě)
- ethery, nitroderiváty, estery, aminy, amidy,
karboxylové kyseliny, sulfokyseliny
-  retence polárních látek velmi malá ■ kb ovJjv/jj; voJbou dJ-J*
-  retence iontových látek (solí) - prakticky nulová
■ ks ovJjvfjji: volbou pj-J*
Kapalinová chromatografie
• SEPAROVANÉ SLOŽKY v LLC
- vJiv pJ-J",v mi -zuénu kiiyi\ďth'\zh oomku
•  V ALKALICKÉM PROSTŘEDÍ POTLAČENA IONIZACE BAŽÍ                     - zvýšení jejich retence
•  V ALKALICKÉM PROSTŘEDÍ ZNAČNÁ DISOCIACE KYSELIN               - omezení jejich retence
•  V KYSELÉM PROSTŘEDÍ POTLAČENA DISOCIACE SLABÝCH KYSELIN       - zvýšení jejich retence
•  V KYSELÉM PROSTŘEDÍ PROTONACE BAŽÍ
- omezení jejich retence
Kapalinová chromatografie
SEPAROVANÉ SLOŽKY v LLC
i
i.
anilin
8
-»-    pH mobilní fáze
12
Kapalinová chromatografie
SEPAROVANÉ SLOŽKY v LLC
E o
co
CO
10
8
6   -
4   *
3.5
sulfachinoxalin
Sulfamethoxazol
sulfadimidin ■-------b----------
sulfamerazine
4.5
5.5
6.5                  7.5
pH mobilní fáze
Kapalinová chromatografie
• TEORIE LSC (kapalinová adsorpční)
- interakce složek vzorku v mobilní fázi s adsorbentem
(tuhou stacionární fází)
• ADSORBENT ■ kulovité částice ■ 0 ~ 10 um
• adsorpční distribuční konstanty
- obsah složky J ve stacionární fázi - mol.g1
- obsah složky J v mobilní fázi - mol.cnr3
•  MECHANISMUS ADSORPCE
- POVRCH ADSORBENTU OBSAZEN ELUENTEM
- SILNĚJI SE ADSORBUJÍCÍ SLOŽKA VYTĚSŇUJE
ELUENT
Kapalinová chromatografie
MECHANISMUS ADSORPCE
- adsorpční rovnováha
- popis - ADSORPČNÍ ISOTERMY
- LANGMUIROVA ISOTERMA - tvorba monovrstvy
»lineární v oboru nízkých koncentrací
tvar isotermy ovlivňuje tvar chromatografického píku
» Gaussův profil pro lineární isotermu
»„protažené píky" („chvostování") - nelineární část isotermy (příliš vysoké koncentrace)
Kapalinová chromatografie
• STACIONÁRNÍ FÁZE pro LSC
• ADSORBENT ■ kulovité částice ■ 0 ~ 10 um
• obvykle silně polární
• plně porézní
-silikagel - hydratované Si02- KYSELOST POVRCHU » NUTNÁ AKTIVACE - „přiměřené" vysušení » SILNÁ RETENCE BAZICKÝCH LÁTEK »silikagel s velkými póry » s malými póry - pod 10 nm
-alumina-OXID HLINITÝ
- hydroxylové skupiny na povrchu
- silné elektrostatické pole u povrchu - Florisil - kremičitan horečnatý
Kapalinová chromatografie
• STACIONÁRNÍ FÁZE pro LSC
• ADSORBENT ■ kulovité částice ■ 0 ~ 10 um
-alumina-OXID HLINITÝ
» BAZICITA POVRCHU - DĚLENÍ SLABĚ KYSELÝCH
SLOŽEK - silné kyseliny - CHEMISORPCE »silné elektrostatické pole u povrchu »při přiblížení adsorbatu
- v molekule indukovaný dipól-moment »vliv geometrie adsorbatu - (ne)planarita » AKTIVACE -podobná jako u silikagelu
- Florisil - kremičitan horečnatý
Kapalinová chromatografie
• STACIONÁRNÍ FÁZE pro LSC
• ADSORBENT ■ kulovité částice ■ 0 ~ 10 um - Florisil - kremičitan horečnatý »polární adsorbent
»vlastnosti - mezi silikagelem a aluminou » 84% Si02,15,5% MgO, 0,5% Na2S04 » ENVIRONMENTÁLNI ANALÝZY » SEPARACE POLÁRNÍCH LÁTEK z nepolárních
matric
»separace chlorovaných pesticidů a PCB
»analýza organofosfátů
»separace steroidů
»separace dusíkatých látek od uhlovodíků
Kapalinová chromatografie
• MOBILNÍ FÁZE pro LSC
-  odplyněná, zbavená prachových částic
-  nepolární mobilní fáze (polární jsou adsorbenty)
-  stupnice dle eluční síly (empirický parametr)
*  větší eluční síla - eluent pevněji sorbován
*  pentan - cyklohexan - benzen - diethylether - dichlormethan -aceton - isopropanol - voda
*  BĚŽNĚ POUŽÍVÁNY BINÁRNÍ ELUENTY
- např. HEXAN + diethylether
- GRADIENTOVA ELUČNÍ CHROMATOGRAFIE
» PLYNULÉ ČI „SKOKOVÉ" ZMĚNY SLOŽENÍ MOBILNÍ FÁZE
Kapalinová chromatografie
• SEPAROVANÉ SLOŽKY v LSC
- polární sorbent A více zadržovány polární látky, látky
s větší molekulovou hmotností
- málo zadržovány - nepolární uhlovodíky
- na kyselém sorbentu - více zadržovány bazické látky
- na bazickém sorbentu - více zadržovány kyseliny
Kapalinová chromatografie - LC
Uzavřený systém pro H PLC
1. Zásobník mobilní fáze                                           2. Vysokotlaká čerpadla
3. Měřidlo tlaku                      4. Filtr                        5. Tlumič tlakových pulsů
6. Kolona                                                7.Dávkovač vzorku - pomocí ventilů
8. Detektor(y)                                                        9. Vyhodnocovací zařízení
• Kapalinová chromatografie - LC
•  Typy kolon pro HPLC - dle vnitřního průměru
-  KAPILÁRNÍ KOLONY ~ desítky až stovky mikrometrů
-  MIKROKOLONY ~ 1 mm
-  „NARROW-BORE" KOLONY - 2 mm
- ANALYTICKÉ KOLONY - 2 -10 mm
- SEMIPREPARATIVNÍ KOLONY ~ 10 - 25 mm
-  PREPARATIVNÍ KOLONY ■ nad 25 mm
•   délky - běžně ■ 10 -100 cm
•   MATERIÁLY
-  nerezová ocel
- tvrzené sklo
- Ti-Zr
-  PEEK ■ poly(ether-ether-ketone), /poly(arylether-ether-ketone)
• Kapalinová chromatografie - LC
• Detektory pro LC
- CHYBÍ UNIVERZÁLNÍ
- OBTÍŽNÁ PREDIKCE ZÁVISLOSTI ODEZVY NA KONCENTRACI JEDNOTLIVÝCH SLOŽEK
- SLOŽITÉ KALIBRACE PRO KVANTITATIVNÍ ANALÝZU - NEPŘENOSNÉ MEZI PŘÍSTROJI
- OPTICKÉ, ELEKTROCHEMICKÉ
- „POMLČKOVÉ TECHNIKY" ■ LC-MS, LC-FTIR atd.
• Kapalinová chromatografie - LC
• Typy detektorů pro LC ■
- OPTICKÉ
*  fotometrický - nejvíce rozšířen v kolonové chromatografii
» UV-vis-fotometr
*  fluorometrický - řádově vyšší citlivost a nižší mez
detekce než pro fotometrický detektor
*  refraktometrický - měření indexu lomu a jeho změn,
pro jakýkoli typ látky, - NELZE PŘI GRADIENTOVĚ ELUCI
- ELEKTROCHEMICKÉ
*  voltametrický resp. amperometrický - nutnou podmínkou
dobrá vodivost samotné mobilní fáze
*  vodivostní - iontové formy složek vzorku, omezené použití
• Kapalinová chromatografie - LC
• Typy detektorů pro LC ■ - fotometrický/spektrofotometrický ■
*  průtočná cela - objem 5 -10 ul, optická dráha -10 mm
*  deuteriova výbojka pro UV oblast, halogenová žárovka pro viditelnou oblast
*  různé vlnové délky - nastavitelné - jednokanálová
detekce
*  měření širšího spektrálního úseku - mnohakanalova
detekce - diodová pole (CCD)
*  problém eluentů absorbujících v UV oblasti
*  problémy při gradientově eluci
• Kapalinová chromatografie - LC
• Typy detektorů pro LC ■ - fluorimetrický/spektrofluorimetrický -
*  průtočná cela - objem 5 -10 ul,
*  deuteriova výbojka pro UV oblast, halogenová žárovka pro viditelnou oblast
*  EXCITAČNÍ MONOCHROMATOR
*  různé vlnové délky EMITOVANÉHO záření - nastavitelné -
jednokanálová detekce
*  měření širšího spektrálního úseku - mnohakanálová
detekce - diodová pole (CCD)
*  VYSOKÁ CITLIVOST, MOŽNOST DETEKCE NIŽŠÍCH KONCENTRACÍ NEŽ FOTOMETRICKÝ
*  složky musí fluoreskovat, nebo je možné je snadno převést na fluoreskující látky
• Kapalinová chromatografie - LC
• Typy detektorů pro LC ■ - diferenciální refraktometrický -
*  kontinuální záznam ROZDÍLU indexů lomu mezi výtokem z kolony a čistým elučním činidlem
*  použitelné pro jakýkoli typ látky
•  NELZE POUŽÍT PRO GRADIENTOVOU ELUCI
•  INDEX LOMU SE MĚNÍ S TEPLOTOU
- NUTNO TERMOSTATOVAT
*  málo citlivé
• POUŽITÍ TAM, KDE NELZE POUŽÍT PŘEDCHOZÍ UVÁDĚNÉ DETEKTORY
• Kapalinová chromatografie - LC
• Typy detektorů pro LC ■ - voltametrický/amperometrický -
*  vhodný pro organické depolarizárory (látky oxidovatelné
či látky redukovatelné)
*  obvykle měření při konstantním potenciálu
*  průtočné uspořádání
* jedna polarizovatelná elektroda
- dvou- či tří- elektrodové zapojení
*  využití oxidační reakce - fenoly, aromatické aminy, thioly,
peroxidy
*  využití redukční reakce - ketony, aldehydy, nitrosloučeniny, konjugované estery, konjugované nitrily
*  NUTNÁ DOSTATEČNÁ VODIVOST MOBILNÍ FÁZE
30
•  GELOVÁ PERMEAČNÍ chromatografie - GPC
•   DĚLENÍ DLE ROZDÍLŮ VE VELIKOSTI MOLEKUL
- STACIONÁRNÍ FÁZE - póry o definované velikosti
- MOBILNÍ FÁZE - teoreticky pouze transport látek
- dělení složek podle HYDRODYNAMICKÉHO PRŮMĚRU MOLEKUL
- MENŠÍ MOLEKULY VSTUPUJÍ DO PÓRŮ
•  čím menší molekuly, tím více času stráví v pórech
•  otázka velikosti pórů, jejich uniformity a tvaru
•  sekundární efekt - adsorpce
• Viy = A - B log Mr(J)
- použitelné pro homologické řady látek
- problém strukturně odlišných látek
•  GELOVÁ PERMEAČNÍ chromatografie - GPC
•   DĚLENÍ DLE ROZDÍLŮ VE VELIKOSTI MOLEKUL
-  STACIONÁRNÍ FÁZE
*  univerzální - silikagely a skelné materiály - Porasil, Spherosil, Bio-Glass
*  pro vodné mobilní fáze (tlumivé roztoky)
- dělení polypetidů, proteinů a dalších
biomakromolekul - Sephadexy - dextran
zesíťovaný epichlorhydrinem
*  pro organické eluenty (jako eluent běžně THF)
- divinylbenzenem zesíťovaný polystyren - Styragel
- PRÁCE ZA BĚŽNÉ ČI ZVÝŠENÉ TEPLOTY
• IONTOVÁ chromatografie - IEC
IONTOVĚ VÝMĚNNÁ CHROMATOGRAFIE
-  SEPARACE NABITÝCH ČÁSTIC ■ IONTŮ
-  nenabité částice teoreticky procházejí bez zadržení
•  ZÁKLAD STACIONÁRNÍ FÁZE
- MĚNIČE IONTŮ - IONTOMĚNIČE
-  nosič - zesíťovaný polystyren, porézní silikagel
*  na stacionární fázi chemicky navázané ionty, k nim elektrostaticky fixovány opačně nabité protiionty
- protiionty shodné s jedním z iotů mobilní fáze
- PŘI SEPARACI protiion ZAMĚNĚN ZA STEJNĚ NABITÝ ION SEPAROVANÉ SLOŽKY, zpětná záměna
přebytkem iontů z mobilní fáze
» DOBA SETRVÁNÍ IONTU SLOŽKY NA POVRCHU
• IONTOVÁ chromatografie - IEC • IONTOVĚ VÝMĚNNÁ CHROMATOGRAFIE
•  AFINITA POHYBUJÍCÍCH SE IONTŮ K FIXOVANÉMU IONTOVÉMU MÍSTU
•  OBVYKLE VE VODNÉM PROSTŘEDÍ
- KATEXY ■ VÝMĚNA KATIONTŮ ■ silně a slabě kyselé
» CHEMICKY VÁZANÉ ANIONTY - SULFONOVE SKUPINY
- KARBOXYLOVÉ SKUPINY » VÝMĚNA PROTONŮ, SODÍKOVÝCH IONTŮ, DRASELNÝCH
- ANEXY - VÝMĚNA ANIONTŮ - silně a slabě bazické
» KVARTÉRNÍ DUSÍKATÉ BÁZE
» PRIMÁRNÍ ČI SEKUNDÁRNÍ AMINY
• IONTOVÁ chromatografie - IEC
• IONTOVĚ VÝMĚNNÁ CHROMATOGRAFIE
- DOBA SETRVÁNÍ IONTU SLOŽKY NA POVRCHU
•  IONTY S VĚTŠÍM NÁBOJEM ZADRŽOVÁNY VÍCE
•  IONTY S VĚTŠÍ HMOTNOSTÍ ZADRŽOVÁNY VÍCE
•  otázka disociačních rovnováh - nutná podpora disociace slabých protolytů
- DETEKCE
•  VODIVOSTNÍ DETEKTOR - nutno předem potlačit velkou vodivost H+ nebo OH- (potlačovací kolona před detektorem)
•  pro některé anionty - FOTOMETRICKÝ DETEKTOR
r           r
chromatografie
S MOBILNÍ FAZÍ V NADKRITICKEM STAVU
SFC
r            r                                                                             v            r
MOBILNÍ FÁZE ■ ZKAPALNĚNY PLYN ■ (C02)
-  kolona má vyšší teplotu než je kritická teplota zkapalněného plynu
-  pracovní tlak značně vyšší než tlak kritický
- v koloně „velmi hustý plyn"
*  klíčová rozpouštěcí schopnost SF mobilních fází
- pro SF C02 - podobná hexanu
*  nízká viskosita proti kapalinám
* vyšší difusní koeficienty než v kapalinách
-VHODNÉ PRO VYSOKOMOLEKULÁRNI LÁTKY
r          r
chromatografie
S MOBILNÍ FAZÍ V NADKRITICKEM STAVU
SFC
MOBILNÍ FÁZE ■ ZKAPALNĚNÝ PLYN ■ (C02)
- VHODNÉ PRO VYSOKOMOLEKULÁRNI LÁTKY
*  látky, které nelze převést do plynné fáze (hmotnost, termolabilita) - NEPOUŽITELNÁ GC
*  látky nelze detegovat běžnými detektory kapalinové chromatografie - NEPOUŽITELNÁ LC
* CHROMATOGRAF PODOBNÝ JAKO PRO GC
- doplněno DÁVKOVAČEM zkapalněného plynu
- preferovány KAPILÁRNÍ kolony
- kolony o menším průměru (0,05 - 0,1 mm)
a kratší délce (5 -10 m) než v GC
• chromatografie
S MOBILNÍ FÁZÍ V NADKRITICKÉM STAVU -
SFC
• MOBILNÍ FÁZE ■ ZKAPALNĚNÝ PLYN ■ (C02)
•  CHROMATOGRAF PODOBNÝ JAKO PRO GC
•  DETEKTOR - obvykle PLAMENOVÝ IONIZAČNÍ
*  lze kombinovat s MS detekcí
*  namísto gradientu složení mobilní fáze (LC) nebo teplotního programu (GC) - programově řízený TLAK
v SFC
• chromatografie
S MOBILNÍ FÁZÍ V NADKRITICKÉM STAVU -
SFC
• MOBILNÍ FÁZE-ZKAPALNĚNÝ PLYN -
-  C02 - neběžnější, pro polární látky přídavek methanolu
-  SF6, - vyšší kritická teplota, nižší kritický tlak,
problém koroze FID
- xenon - nízká kritická teplota,
NEABSORBUJE V UV-oblasti - použitelná
fotometrická detekce
• ELEKTROMIGRAČNÍ METODY
•  POHYB NABITÝCH ČÁSTIC VLIVEM STEJNOSMĚRNÉHO ELEKTRICKÉHO POLE
•  dělení v kapalné fázi („kapalné fázi")
•  polární prostředí (mnohdy vodné)
•  síla působící na nabitou částici
-  F^ = QE = zeE,                   E- intenzita pole
• uvedení iontů do pohybu
•  síla brzdná - odpor prostředí
-  F2 = -k v = - 6tt f] r v,             v- rychlost pohybu částice,
r\ - dynamická viskosita r-poloměr iontu
• ELEKTROMIGRAČNÍ METODY
•   POHYB NABITÝCH ČÁSTIC VLIVEM STEJNOSMĚRNÉHO ELEKTRICKÉHO POLE
-QE = kv
-v=QEIk=uE, u - pohyblivost částice - pohyblivost částice - ovlivněmi
*  viskositou prostředí
*  rozměrem a tvarem iontů
*  nábojem iontů
*  mírou disociace dané látky
•  DĚLENÍ DLE ODLIŠNÝCH POHYBLIVOSTÍ
•  u = vlE,             konstantní E - ELEKTROFORÉZA
konstantní v- IZOTACHOFORÉZA
• ELEKTROMIGRACNI METODY DĚLENÍ DLE ODLIŠNÝCH POHYBLIVOSTÍ
-u = v IE,
- konstantní E- ELEKTROFOREZA
•  1892 - POHYB ANORGANICKÝCH ČÁSTIC V KOLOIDNÍM
ROZTOKU
•  1937 - METODA POHYBLIVÉHO ROZHRANÍ -
Arne Thiselius - dělení proteinů krevního séra (1948-Nobelova cena)
•  1949 - ZÓNOVÁ ELEKTROFOREZA - Pauling (papírový nosič)
•  1955 - GELOVÁ ELEKTROFOREZA - Smithies (škrobový gel)
•  1981 - KAPILÁRNÍ ELEKTROFOREZA - Jorgenson a Lukacsová
•  současnost - ELEKTROFOREZA
NA CHEMICKÝCH MIKROČIPECH
• ELEKTROMIGRACNI METODY
• ELEKTROFOREZA ■ ELFO
- KAPILÁRNÍ
•  Kapilární zónová elektroforéza (CZE)
•  Kapilární gelová elektroforéza (CGE)
- GELOVÁ ZÓNOVÁ ELEKTROFORÉZA
• VERTIKÁLNÍ, HORIZONTÁLNÍ, VÍCEROZMĚRNÁ
•  ŠKROB                          - SGE („STARCH")
•  POLYAKRYLAMID          - PAGE („POLYACRYLAMIDE")
•  ACETYLCELULOSA      ■ CAGE („Cellulose Acetate")
• AGAROSA (agar)            - AGE („AGAROSE")
2D ■ ELEKTROFOREZA

•
F* f
-+
♦*
-  ■- >

'r
*■»-
• *
m                                 —       *

-1   Í
RACNI METODY
například:
•jeden směr IFE
• separace dle pl
• druhý směr SDS-PAGE
(SDS - dodecylsulfat sodný)
• dělení dle molekulové
hmotnosti
w          r
• ELEKTROMIGRACNI METODY
ELEKTROFORÉZA ■ ELFO
- KAPILÁRNI ■ křemenná kapilára s polyimidovým povlakem
kapilára  (prumer 25 - 75 pm)
sběr dat
zdroj vysokého napětí
T-----1------1------T^
detektor
základni elektrolyt VZOREK
základní elektrolyt
• ELEKTROMIGRACNI METODY
• ELEKTROFORÉZA ■ ELFO
- KAPILÁRNI - křemenná kapilára s polyimidovým povlakem
•  objem kapiláry - méně než 10 ul
•  kapilára obvykle vyplněna pufrem, gelem - zlepšení separace
makromolekul
•  dávka vzorku -10 ni •napětí 10-30 kV
•  obvykle spektrofotometrická detekce v „okénku"
v místě bez polyimidového povlaku
•  detekce fluorescenční - LIF - laserem indukovaná fluorescence
•  doba separace - do 10 min
•  peptidy, proteiny, nukleové kyseliny
•  anorganické kationty a anionty
•  iontová farmaka, huminové kyseliny, analýza potravin
• ELEKTROMIGRACNI METODY
DĚLENÍ DLE ODLIŠNÝCH POHYBLIVOSTÍ
-u = v IE,
- konstantní v - IZOTACHOFORÉZA
*  kapilární - objev v 60. letech 20.století
*  dva elektrolyty s odlišnou pohyblivostí iontů
*  elektrolyt s VELKOU pohyblivostí - VEDOUCÍ
*  elektrolyt s MALOU pohyblivostí - KONCOVÝ
*  VZOREK VNÁŠEN NA ROZHRANÍ ELEKTROLYTŮ
-VZOREK SE DĚLÍ DLE POHYBLIVOSTI IONTŮ
V NĚM OBSAŽENÝCH
- vytváří zóny mezi vedoucím a koncovým
elektrolytem - SAMOZAOSTŘUJÍCÍ EFEKT -všechny zóny se pohybují stejnou rychlostí
w          r
ELEKTROMIGRACNI METODY
O
TE
ABC
O
LE
TE
BC
ABC
AB
LE
<3	TE			C	B	A	LE
				C	B	A	
	fí	\					ustáli
							
							
<—L
IZOTACHOFOREZA - pohyb aniontů
w          r
ELEKTROMIGRACNI METODY
• ELEKTROMIGRACNI METODY
• IZOTACHOFOREGRAM
- VÝŠKA ZÓNY - kvalitativní informace o iontech
*  souvisí s vodivostí dané zóny - s pohyblivostí iontů
- DÉLKA ZÓNY ■ KVANTITATIVNÍ INFORMACE
*  koncentrace látek v zónách dána složením a koncentrací vedoucího elektrolytu (všemi zónami protéká stejný proud) - pro danou látku konstantní přes celou zónu -délkou zóny tak dáno celkové látkové množství daného iontu
- DÉLKA ZÓNY ■ vzdálenost maxim na derivačním záznamu
• ELEKTROMIGRACNI METODY
• konstantní v- IZOTACHOFORÉZA
- intenzita elektrického pole charakteristická pro zónu
- KATIONTOVÁ ■ DĚLENÍ DLE POHYBLIVOSTI KATIONTŮ
- ANIONTOVÁ ■ DĚLENÍ DLE POHYBLIVOSTI ANIONTŮ
- INSTRUMENTÁLNÍ VYBAVENÍ
- separační kapilára - průměr 0,5 mm, délka až 50 cm,
PTFE, FEP - perfluorovaný PE + PP
- objem vzorky ■ m i kro I i try - kohout či stříkačka
- používané napětí - řádově kV
- STABILIZOVANÝ PROUD ■ STOVKY MIKROAMPÉR
- vodivostní detektor, teplotní detektor, UV-detektor
• ELEKTROMIGRAČNÍ METODY
• konstantní v- IZOTACHOFORÉZA
- INSTRUMENTÁLNÍ VYBAVENÍ
				koncový elektrolyt
				
			TE	
			pflŕ	: -         -1     Nástřikové zařízení
zdroj konstai proudu	ítního		A— b —	— separační kapilára
				------   Sběr dot
				
^4hv			4	
f				^^ vedoucí elektrolyt
• ELEKTROMIGRAČNÍ METODY
• konstantní v- IZOTACHOFORÉZA
- aplikace
• ANALÝZA IONOGENNÍCH LÁTEK V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ
• ANALÝZA POTRAVIN •BIOCHEMICKÁ ANALÝZA
- KOMBINACE IZOTACHOFORÉZY A ELEKTROFORÉZY
•  IZOTACHOFORÉZA ■ ZAKONCENTROVAN í SLOŽEK DO ZÓN
•  ELEKTROFOREZA - VYSOKÉ ROZLIŠENÍ SLOŽEK