Analýza organických látek Luminiscenční spektroskopie Rozdělení luminiscence podle zdroje excitace Typy přechodů Typy přechodů Přechod σ - σ*^ : jednoduché vazby (např. C-C, nebo C-H), vyžadují velikou energii (méně než 190nm, vakuová oblast) Přechod n - σ*^ : nutná přítomnost atomu s volným elektronovým párem (N, S, I, Cl, Br), absorpce kolem 200nm. Přechod π – π*: sloučeniny s dvojnými a trojnými vazbami, čím lepší konjugance vazeb, tím vyšší vlnová délka (energetická hladina nejvyššího obsazeného vazebného orbital se zvýší a energetická hladina nejnižšího nevazebného orbitalu se sníží → nižší ΔE), delokalizované π orbitaly aromatických systémů → rozdíl energií je nízký (absorpce ve Vis oblasti) n – π*: v molekule je kromě dvojné vazby přítomen také atom s volným elektronovým párem (N, S, Cl...), nízká energie, ovlivnění π – π* přechodu Luminiscence molekuly je charakterizována: emisní spektrum (emisní maximum), excitační spektrum (excitační maximum), Stokesův posun, kvantový výtěžek, čas vyhasínání luminiscence Emisní a excitační spektra Emisní a excitační spektra • Stokesův posun: rozdíl mezi emisním a excitačním maximem (v nm) • Kashovo pravidlo: tvar emisního spektra není ovlivněn vlnovou délkou excitace a lze excitovat zářením s kteroukoli vlnovou délkou z excitačního spektra • nejvyšší intenzita luminiscence: excitace vlnovou délkou rovnou excitačnímu maximu • fosforescenční spektra jsou posunuty k vyšším vlnovým délkám, neboť přechod z T[1] do S[0] je spojen s menším rozdílem energie, než přechod z S[1] do S[0 ] Základní vztahy Stanovení proteinů Časově rozlišená luminiscence I = I[0] exp -(t/t) Výtěžek luminiscence • obecná definice: φ = k[f] / (k[f] + k[i] + k[x]) k[f][ ]rychlost emisního procesu (fluorescence) k[i] rychlost nezářivých přechodů (teplo, relaxace...) k[x] rychlost mezisystémových přechodů - jestliže rychlost deaktivačních procesů je pomalá ve srovnání s k[f] potom kvantový výtěžek je vysoký • kvantový výtěžek: φ[k] = N[em]/N[abs] = I[em]/I[abs] = I[em]/(I[0]-I) • energitcký výtěžek: φ[e] = E[em]/E[abs] = hν[em]/hν[ex] [ ] Schéma měření fluorescence Struktura organických molekul a luminiscence – základní pravidla Základní pravidla 4. Aromatické systémy s přechody n→π* zvyšují intensitu fluorescence (molekuly obsahují atomy s nevazebnými elektrony – N, O, S). U jednoduchých molekul obsahujících karbonylovou skupinu (např. benzofenony), nebo heteroatomy (pyrimidin, pyrazin) je často pozorována i fosforescence. • Skupiny připojené na aromatické jádro často silně ovlivňují fluorescenční vlastnosti molekuly. Tyto skupiny mohou měnit polohu nejnižší vibrační hladiny excitovaného stavu (týká se to jak n→π*, tak i π→π* přechodů) – viz. tabulka. • jestliže je na aromatickém jádře halový prvek můžeme pozorovat tzv. efekt těžkého atomu: přítomnost těžkého prvku zvyšuje pravděpodobnost přechodu na S[0 ]→ T[1], což má vliv na zvýšení Φ[P]. • jestliže jsou aromatická jádra téže molekuly oddělena alkyovou skupinou je systém slabě, nebo vůbec konjugován (menší kvantový výtěžek, nižší vlnová délka emise). Luminiscence a struktura Chinin Deriváty fluoresceinu Vnitřní a vnější luminiscence • vnitřní/intrinsic (nativní luminiscence) – molekuly lze stanovit bez výrazného zásahu do sledovaného systému, zpravidla aromatické látké • vnější/extrinsic luminiscence – do sledovaného systému přidáme fluoreskující činidlo(barvivo), jehož fluorescence bude závislá na koncentraci analytu, případně se na něj naváže Fluorescenční značky a sondy • fluorescenční značky (fluorescent labels) jsou vnější (extrinsic fluorescence) fluorofory, které se ke sledovaným biomolekulám (proteinům, peptidům, ligandům, oligonukleotidům a jiným) vážou kovalentní vazbou • fluorescenční sondy (fluorescent probes) jsou vnější fluorofory, které se ke sledované struktuře vážou nekovalentně a často přitom mění své fluorescenční vlastnosti. Fluorescenční značky – vazebná místa amino-reaktivní značky Fluorescenční imunoanalýza (FIA) • poprvé použity v roce 1964 • často ovlivněna fluorescencí matrice a samotného vzorku • může být použita i TR-FIA (Time Resolved Fluorescence Immuno Assay). Tato metoda využívá jako značek chelátů s lanthanitých kationtů (Eu^3+, Tb^3+, Sm^3+ a dalších) • FIA lze provádět v homogenním i heterogenním prostředí, v kompetitivním i nekompetitivním uspořádání Fluorogenní substráty – stanovení enzymatické aktivity Princip: volný fluorofor má jiné luminiscenční vlastnosti, než když je navázaný na biomolekulu. Fluorofor je na biomolekulu navázán vazbou, kterou štěpí stanovovaný enzym. Fluorimetrická EIA • Enyzmoimunoanalýza v homogenním (EIA) a heterogenním prostředí (ELISA) Fluorescenční sondy • vnější fluorofory, které se ke sledovaným molekulám, iontům, atd. váží nekovalentní vazbou • změna fluorescenční vlastností (intenzita emise, posun emisního maxima, změna času vyhasínání) • Princip: různý vliv na Franck-Condonův excitovaný stav Analýza organických látek Chiroptické metody Rovinně a cirkulárně polarizované světlo ORD a CD • Optická Rotační Disperze (ORD) – závislost velikosti optické aktivity (závislost úhlu stočení) na vlnové délce • Cirkulární Dichroismus (CD) – jestliže absorpce R a L kruhově polarizované složky záření opticky aktivní látkou je různá, zároveň může být různá velikost optické aktivity CD [• ]Jednotka: Δε = ε[L ]–ε[R ] • Jiná jednotka je (molární) elipticita [q] • Přepočet mezi elipticitou a Δε: [q] = 3298,2 Δε • Jednotka [q] : stupně elipticity • Nejzajímavější oblast pro studium struktury látek: pod 200 nm (pracujeme v dusíkové atmosféře) Využití CD pro studium sekundárních struktur proteinů Studium sekundární struktury proteinů – „čistá“ spektra Výhody x nevýhody - není v určování sekundární struktury tak specifická jako NMR, nebo RTG strukturní analýza (proteinová krystalografie) + možnost použití při různých podmínkách (roztoky, teplota, pH) + komplementarita k metodám, kdy je možné měřit jen vzorky v pevné fázi