Chiroptické metody Asymetrický uhlík • většina opticky aktivních látek má asymetrický uhlík (čtyři odlišné substituenty) • neplatí vždy: jsou známy i molekuly s asymetrickými C, které nejsou opticky aktivní, protože mají rovinu, nebo střed souměrnosti, naopak, některé opt.aktivní látky asymetrický uhlík nemají a jejich aktivitu působí asymetrie celé molekuly. Např.deriváty bifenylu, allenů, kde jsou roviny dvojných vazeb k sobě kolmé. • Pravidlo: má-li sloučenina n středů chirality, má 2^n stereoizomerů a 2^n/2 dvojic antipodů. Opticky aktivní látky • podle stáčení roviny polarizovaného světla rozlišujeme látky na levo- a pravotočivé (L a D). • pravo- a levotočivé izomery se nazývají enantiomery (optické antipody) • směs enatiomerů v poměru 1:1 – racemická směs (opticky neaktivní) • opticky aktivní látky jsou často organické molekuly s asymetrickým uhlíkem, ale existuje i celá řada anorganických látek s optickou aktivitou Princip chiroptických metod • využíváme schopnosti opticky aktivních látek stáčet rovinu polarizovaného světla • světlo je elektromagnetické vlnění, které obsahuje dvě vlnové složky – elektrickou (E) a magnetickou (M). Vektor E složky kmitá kolmo ke směru šíření světla. • nepolarizované světlo – směr vektoru E se nahodile mění • lineárně (rovinně) polarizované světlo: elektrická a magnetická složka jsou na sebe kolmé, E kmitá jen v jednom směru (v jedné rovině) • kruhově (cirkulárně) polarizované světlo – elektrický (i magnetický) vektor koná rotační pohyb (buď doprava, nebo doleva) ve směru šíření paprsku Princip Rovinně a cirkulárně polarizované světlo Rovinně a cirkulárně polarizované světlo Otáčivost • opticky aktivní látky mají různý index lomu pro R a L složky polarizovaného světla (= rychlost světla v tomto prostředí pro R složku je jiná, než pro L složku, složka pro kterou index lomu nižší se šíří rychleji) • mezi složkami vzniká fázový rozdíl, protože rychlejší paprsek má větší vlnovou délku. • vektorový součet obou složek dává rovinu polarizovaného světla pootočenou doprava, nebo doleva • fázový rozdíl a úhel otočení roviny polarizovaného světla je přímo úměrný počtu opticky aktivních molekul v dráze paprsku α = [α]^20[λ][ ]l c [ ] • α = úhel otočení roviny polarizovaného světla • l = tloušťka opticky aktivní vrstvy (v dm) • c = koncentrace látky v g/cm^3 • [α]^20[λ] = měrná otáčivost pro danou látku a vlnovou délku, t = 20 ^0C Další vztahy • otáčivost je závislá na teplotě (s rostoucí teplotou klesá) [α]^t[λ] = [α]^20c + k (t – 20) • pracujeme-li v širokém koncentračním rozmezí, tak platí: [α]^t[λ] = A + Bc + Cc^2^ Polarimetrie • většinou se uvádí pro záření vlnovou délkou dubletu sodíkové výbojky (D) – 589 nm • rovinně polarizované světlo vzniká při odrazu, lomu, dvojlomu, atd. • u klasických polarimetrů je to zpravidla dvojlom na nikolu (islandský vápenec) Dvojlom • V opticky stejnorodém prostředí se světlo šíří všemi směry a stejnou rychlostí, ale krystaly některých látek jsou z hlediska šíření světla nestejnorodé rychlost světla v různých směrech různá. Jestliže na takový krystal dopadá světlo, nastává dvojlom. Světelný paprsek se na rozhraní s krystalem rozdělí na dva paprsky: paprsek mimořádný a paprsek řádný. Oba paprsky jsou lineárně polarizované. • Nejznámějším minerálem s touto vlastností je islandský vápenec, který tvoří čiré a často poměrně velké krystaly. Položíme-li krystal na kresbu uvidíme ji zdvojeně (obr.). to je způsobeno zdvojením paprsku. Polarizace absorpcí světla • V technické praxi se k polarizaci světla používají speciální polarizační filtry (polaroidy). Jsou zhotoveny z plastického materiálu, který obsahuje látku s poměrně dlouhými molekulami. Ty jsou vhodným technologickým postupem srovnány, tak že osy molekul jsou rovnoběžné. Proto když světlo prochází polarizačním filtrem je elektrická složka světelného vlnění, která není kolmá na osy molekul ve filtru filtrem neprochází. To znamená, že polaroid procházející světlo zeslabuje. Analyzátory • Polarizované světlo se nijak od světla přirozeného nijak neliší. K tomu abychom určili orientaci roviny polarizovaného světla musíme zařízení zvané analyzátor. Ten tvoří opět vhodný polarizační prostředek, který propouští světlo jen s určitou orientací kmitové roviny. • Podstata funkce analyzátoru a polarizátoru. Pokud jsou štěrbiny polarizátoru i analyzátoru rovnoběžné světlo prochází. Pokud nejsou štěrbiny rovnoběžné světlo neprochází a analyzátor se jeví jako temný (obr.) Princip polarimetru ORD • Optická Rotační Disperze (ORD) – závislost velikosti optické aktivity (závislost úhlu stočení) na vlnové délce. CD • Cirkulární Dichroismus (CD) – jestliže absorpce R a L kruhově polarizované složky záření opticky aktivní látkou je různá. • křivky CD spektrometrie vyjadřují závislost rozdílu molárních absorpčních koeficientů pro L a R složku na vlnové délce [• ]Jednotka: Δε = ε[L ]–ε[R ] • Jiná jednotka je (molární) elipticita [q] • Přepočet mezi elipticitou a Δε: [q] = 3298,2 Δε • Jednotka [q] : stupně elipticity Využití CD • konformační studia peptidů, proteinů, DNA • studium denaturace biopolymerů (tepelná, chemická, atd) • studium strukturních změn Využití CD pro studium sekundárních struktur proteinů Studium sekundární struktury proteinů – „čistá“ spektra Výhody x nevýhody - není v určování sekundární struktury tak specifická jako NMR, nebo RTG strukturní analýza (proteinová krystalografie) + možnost použití při různých podmínkách (roztoky, teplota, pH) + komplementarita k metodám, kdy je možné měřit jen vzorky v pevné fázi