GLP v biologii - syllabus
GLP v biologii - přehled aplikací a postupů vyžadujících GLP
Český lékopis 1997 / 2002 - základní struktura
Laboratorní a pokusná zvířata (zák. 246/1992, vyhl. 311/1997)
- požadavky, legislativa, toxikologické studie
Alternativní testovací systémy
- výhody, využití, příklady, validace
Problematika GMO
(zákon 153/2000, vyhl. 372, 373, 374/2000)
Přehled OECD Guidlines
GLP v biologii
* Experimentální biologie (věda)
* Praktická biochemie a biologie
­ mikrobiologie (potraviny, pitná voda)
­ kvalita léčiv (výroba, kontrola)
­ lékařská biologie a biochemie
­ průmyslové chemické látky, potravní aditiva ... a
jejich bezpečnost
* toxikologie
* ekotoxikologie
* biodegradabilita
GLP v biologii - Př. STUDIE
* Ukázka STUDIE v režimu "GLP"
* 8 zvířat (prasat)
* aplikace aspirinu
* odběry krve v definovaných časech (0-144 h)
* sledování hladin metabolitů K. AcSal
* vyhodnocení farmakokinetiky
GLP v biologii - LÉKOPIS
* Český lékopis 1997 a 2002
* Aktuální: Vyhláška MZd ČR č. 180 / 2002
Požadavky na jakost, postup při přípravě,
zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv
GLP v biologii: MODELY
* Mnoho přístupů v biologii
* Obratlovci:
­ in vivo (zvířata)
­ ex vivo (orgány zvířat)
­ in vitro (buňky, buněčné linie)
* Bezobratlí
* Rostliny
* Bakterie
GLP & Využití zvířat
* Právní rámec
­ Zákon o ochraně zvířat
­ CO je zvíře,
* typy zvířat, laboratorní / pokusné ...
­ KDO a KDY smí zvířata využívat
* registrace ÚKOZ (MZe)
­ JAK lze experimenty realizovat (.... ->GLP)
* projekt pokusu
* protokol pokusu, evidence
Využití zvířat - význam
* Unikátní 3D prostorové uspořádání
* Fyziologické a Farmako(Toxo)kinetické
procesy
* Komplexní účinky
* Mnoho látek má více mechanismů toxického
efektu ­ nutno testovat in vivo ...
Kdy lze využít zvířat ?
* Kdy lze ke zkoušení využít zvířat:
­ výroba, vývoj, kontrola kvality, nezávadnosti a
účinnosti léčiv, biopreparátů, potravin a event.
jiných výrobků
­ studium nemocí, prevence, diagnostika, léčení
­ studium fyziologických procesů
­ ochrana životního prostředí
­ výuka na SŠ a VŠ
Kdy se zkoušení na zvířatech
vyžaduje ?
OCHRANA ČLOVĚKA a HOSP. ZVÍŘAT
* potraviny, zemědělské látky
* kontrola léčiv
* výroba léčiv - farmakologické preklinické
studie
­ farmakokinetika
­ nežádoucí účinky
* toxicita (akutní, chronická)
* mutagenita, kancerogenita
* reprodukční toxicita
AKUTNÍ TOXICITA
* přesná specifikace látky (čistota, kvalita, více
substancí ­ složení ...)
* zvířata: dva druhy, obě pohlaví
­ charakterizace (dodavatel, kmen, věk....)
* dávky: plánovaná (mg/kg) & více koncentrací
- odhad LD50
* aplikace ­ i.v., p.o., i.p. ...
* pozorování a vyšetření (pitva)
* zpracování výsledků - statistika
KLASIFIKACE TOXICITY Kdo může vyhodnocovat pitvu ?
* Pregraduálně
­ veterinární event. humánní lékař
* Postgraduálně patolog s atestací I. st.
­ 5 let praxe v oblasti patologie
­ Ph.D.
­ člen Evropské společnosti veter. patologů
CHRONICKÁ TOXICITA
* opakované podávání
předpokládané / délka studie
* 1-2 d/wk 2 wks
* 1,2,3 ...7 d 4 wks
* Opak 1-30 d 4 months
* Opak > 30 d 6 months
* látka, zvířata, velikost skupin, více druhů,
hodnocení, pitva (definované úkony)
REPRODUKČNÍ STUDIE
* zjišťuje se vliv na
­ sexuální chování zvířat
­ prenatální mortalitu
­ fetální abnormality & poškození během života
* Experimenty
­ změny fertility, vliv na F a M gamety (poměry
narozených F a M); toxicita pro embrya a féty,
změny gravidity ovlivňující fety, vliv na růst a
vývoj dělohy a placenty, porod, postnatální vývoj a
laktaci matky, vliv na potomstvo (schopnost učení)
REPRODUKČNÍ STUDIE
* Počty zvířat - minimálně (s výjjimkou primátů)
­ embryotoxicita 20 gravid. F hlodavců
12 gravid. F nehlodavců
­ studie fertility 24 F a 24 M
­ perinatální studie 12 F
* Další podmínky stejné jako u akutní a
chronické toxicity
STUDIE KANCEROGENITY
* Ne vždy korelace zvíře / člověk (!)
* Rozdílné mechanismy ­ nutno zohledňovat
peroxizomální proliferátory: ftaláty
* Řada klasifikačních schémat
­ WHO
­ IARC / Intern. Agency for Research of Cancer
KLASIFIKACE IARC
* Group 1: The agent (mixture) is carcinogenic to humans.
* Group 2
* Group 2A: The agent (mixture) is probably carcinogenic to
humans.
* Group 2B: The agent (mixture) is possibly carcinogenic to
humans.
* Group 3: The agent (mixture or exposure circumstance) is not
classifiable as to its carcinogenicity to humans.
* Group 4: The agent (mixture) is probably not carcinogenic to
humans.
STUDIE KANCEROGENITY
* Povinné provedení:
­ opakované podávání (min 6 měsíců)
­ chemická struktura svědčí o možné kancer.
­ chem. příbuzné kancerogenním látkám
­ látky s retencí v organismu (bioakumulace)
­ mutagenní látky v krátkodobých studiích
* Možné provedení
­ studie dalších látek, vč. kontaminantů... B[a]P ...
STUDIE KANCEROGENITY
* 2 druhy, málo spontánních nádorů,
metabolismus příbuzný člověku, dostatečně
citlivé
* denní aplikace, tři dávky (nejvyšší již vyvolává
nejnižší tox. efekt ­ úbytek hmotnosti ...;
nejnižší ­ 2-3x násobek použité dávky)
* POČTY 50F a 50M:
potkani ­ 24 (až 30)měsíců
myši+křečci ­ 18 (až celoživotně dokud
přežívá 20% kontrolních zvířat)
STUDIE KANCEROGENITY
* Definované podmínky experimentu
* Vyhodnocení
­ úmrtí, počty zvířat s nádory v různých tkáních,
časové rozložení úmrtí; pitva
* srovnání s kontrolou
* dávková závislost
* Statistické vyhodnocení
FARMA(TOXI)KINETIKA
* Vstřebávání
* Distribuce
* Metabolismus
* Vylučování
* Biochemické změny
ALTERNATIVNÍ METODY
k in vivo testů s obratlovci
a GLP
* Obratlovci:
­ in vivo (zvířata)
* Alternativní metody
­ ex vivo (orgány zvířat)
­ in vitro (buňky, buněčné linie)
* Výhody:
­ snižování počtů zvířat
­ mechanistické metody ("dioxinová" toxicita)- dobré interpolace
na in vivo podmínky
­ rychlejší, rel. levnější, více vzorků ...
* Koncept "3R"
­ Reduction (Snižování), Refinement (Zmírňování),
Replacement (Nahrazování)
Alternativní metody (s obratlovci)
* Velké množství experimentálních metod
* Méně metod standardizovaných a
validovaných: ISO.org
ASTM.org
* EU: ecvam.jrc.it (př. Skin Sensitisation Test)
­ ECVAM (European Centre for Validation of
Alternative Methods)
­ Časopis ATLA (Alternatives to Laboratory
Animals)
in vitro buněčné techniky
Stanovení aktivit/toxicit závislých na
intracelulárních receptorech
AhR, ER ­ experimentální design
96 j. deska:
transgenní buněčné linie
H4IIE.luc ­ DR-CALUX
MVLN ­ ER-CALUX
Lyza buněk, zamražení
(uchování enzymových aktivit)
Přídavek vzorků, standardů
Expozice (6 ­ 24 hod)
Lumino
Stanovení LUCIFERÁZOVÉ
(reporterové) aktivity
- komerční detekční kity
další "alternativní" techniky
* Embrya a plody
­ CHEST Chick Embryotoxicity Screening Test
­ FETAX Frog Embryo Teratogenesis Assay
Xenopus (validovaná alternativa testů teratogenity)
Ekotoxikologie
obratlovci, bezobratlí, bakterie
autotrofové (řasy, rostliny)
* Velká skupina experimentálních postupů; řada
validovaných testů
* Při posuzování bezpečnosti je cílem odhadnout
toxicitu (akutní, chronickou, specifickou) pro
zástupce různých skupin, ZEJM. různých
trofických úrovní v ekosystémech:
Příklady testů s organismy z
různých trofických úrovní
* Producenti:
­ řasy, vyšší zelené rostliny
* Konzumenti (1., 2. a vyšších řádů)
­ bezobratlí
­ obratlovci
* Destruenti
­ bakterie
Řasové testy toxicity
- standardní uspořádání
- 96 hod, Erlenmayerovy lahve, třepání
- sledování růstu, počtů buněk,
biomasy ­ kvantifikace chlorofylu (fluorescence)
- miniaturizace
- mikrodestičky
Řasy
Selenastrum capricornutum
Scenendesmus subcapitatus
Sc. quadricauda
Chlorella vulgaris
Sinice
Microcystis aeruginosa
Ekotoxikologické biotesty
- producenti
Daphnia magna
Artemia salina
Ceriodaphnia dubia
Gammarus Chironomus riparius
Živorodka duhová (Paví očko), Poecilia reticulata Danio rerio (syn. Brachydanio rerio)
Karas (zlatá forma)
Pimephales promelas
Pstruh
BAKTERIE jako model v testování
* Snadná kultivace, krátký generační čas,
jednoduché uspořádání (jediná membrána),
jednoduchý genetický aparát
* Využití při testování
­ rychlé (skríningové) testy akutní toxicity
(MICROTOX)
­ genotoxicita - jednoduché sledování poškození
DNA: Amesův test
A) jednodruhové testy
(1) TEST AKUTNÍ TOXICITY - MICROTOX
- mořská luminiscenční bakteri Vibrio fisheri
- krátkodobá expozice testované látce (5-30 min)
- sledování změn přirozené luminiscence ­ odpovídá toxicitě
- uspořádání:
kyvety (zkumavky), stanovení v luminometru
Mikrobiální ekotoxikologické biotesty
Problematika regulace
Geneticky Modifikovaných
Organismů (GMO)
GMO v ČR
* Zákon 153/2000
* Vyhlášky 372, 373, 374/2000 MŽP
* Organismus
­ biologická jednotka (buněčná nebo nebuněčná)
schopná rozmnožování nebo přenosu dědič.
materiálu včetně virů ....
* GMO
­ organismus (kromě člověka) změněný gen.
modifikací
Genetická modifikace - zákon
* rekombinantní techniky vytvářející nové
kombinace DNA - vložení nového úseku
jakýmkoliv způsobem do NK, plazmidu,
vektoru ...
* techniky zavádějící děd. materiál připravený
mimo organismus do organismu (mikroinjekce,
mikroenkapsulace ...)
* techniky buněčné fúze, hybridizace buněk
(!produkce monoklonálních protilátek)
GM není ...
* oplození in vitro
* bakteriální konjugace a všechny podobné
přirozené procesy
* indukce polyploidie a haploidie
* mutageneze
* křížení
Proč regulovat GMO ?
* Předběžná opatrnost
­ stále málo prostudováno
­ neznáme možné důsledky vnášení do prostředí
* Pro každý GMO je třeba zpracovat Analýzu
Rizika
­ detailní posouzení škodlivých účinků a jejich míry
Možné účinky GMO (podle zákona)
* přímé nebo nepřímé škodlivé působení na
člověka, zvířata, rostliny
* onemocnění (GM bakterie)
* alergizace, toxicita
* vliv na dynamiku populací a genetickou
rozmanitost
* omezení možnosti léčby (rezistence vůči ATB)
* účinky na biogeochemické procesy (fixace
dusíku, koloběh uhlíku ...)
Schema regulace
* Ministerstvo
­ seznamy uživatelů (právnické osoby)
­ seznamy GMO pro uzavřené nakládání
­ seznamy GMO pro vnášení do prostředí
­ seznamy GMO pro vnášení do oběhu
* Uživatel
­ registrace a žádost o zápis do příslušného seznamu
* Další: ČIŽP, celní orgány, orgány veterinární
správy, ÚKSÚZ, SZÚ, ÚSKVBL, ČZPI
Povinnosti uživatele - registrace
* Složitá forma žádosti - řada požadavků
­ př. přesná definice genetické změny pro účely
identifikace
* viz příklad - přihláška, p.24
Povinnosti uživatele - registrace
* .....
* Pověřené osoby (vzdělání, praxe ...)
* Odborný poradce
* Před zápisem do seznamu je nutné provedení
analýzy rizika a kategorizace - popis náležitostí
je ve vyhlášce
Analýza rizika - 4 kategorie
* A - bez rizika nebo s min. rizikem škodlivého
působení
* B - riziko, které může být odstraněno obecně
známými opatřeními
* C - riziko, které může být odstraněno jen
zvláštními náročnými zásahy
* D - riziko, které zanechává trvalé následky a
nemůže být zcela odstraněno
Povinnosti uživatele - registrace
* Podle kategorie rizika je nutno zabezpečit
provoz zařízení
­ vybavení (př. p. 4)
­ provozní řád
* identifikace, osoby, seznam a popis pracovních postupů,
výčet GMO a jejich počet, zásady vedení evidence o
provádění sanitace, hygiena, vedení dokumentace ...
* opatření pro případ havárie - speciální havarijní plán
Dokumentace nakládání s GMO
* PLÁN ETAPY
­ účel, údaje o organismu, osoby, specifikace
materiálu, postupy nakládání, likvidace, odpady
­ schválení odborným poradcem
* Provozní deník (každý zápis s podpisem)
­ plán etapy, průběh etapy
­ primární údaje (!)
­ zápisy o kontrolách
* Závěrečná zpráva etapy
Příklady standardizovaných
postupů (Guidelines) pro
hodnocení bezpečnosti
Section 1: Physical Chemical Properties
Section 2: Effects on Biotic Systems
Section 3: Degradation and Accumulation
Section 4: Health Effects
Section 5: Special Activities
OECD GUIDLINES ­ Chemicals Testing
Celkem
86 návodů
OECD sekce 5 ­ Special Activities