MECHANISMY PŮSOBENI MASTNÝCH KYSELIN VE STŘEVĚ A JEJICH VZTAH K ZÁNĚTLIVÝM A NEOPLASTICKÝM ONEMOCNĚNÍM NÁDORY KOLOREKTA (CRC) Výskyt industrializované země (životní styl, výživa) ČR (třetí nejčastější příčina úmrtí na rakovinu) věková distribuce (muži nárůst případů od 60 let; ženy od 70 let) Epitel kolorekta střevní krypty (část proliferační a diferenciační) výměna epitelu (zrání buněk, odumírání apoptózou-anoikis (detachment-induced apoptosis) koncentrace růstových faktorů v kryptách (v proliferační části více buněk produkujících GF) Kolorektální karcinogeneze porušení rovnováhy mezi proliferací a diferenciací v kryptě hyperproliferativní krypta, adenom, adenokarcinom, karcinom, metastázy Germany Austria Portugal Denmark Italy France Belgium European Union The Netherlands United Kingdom Sweden Luxembourg Ireland Spain Finland Greece Incidence per 100,000 people Figure 1 | Colorectal cancer incidence in males in the European Union. Rates of colorectal cancer by incidence, per 100,000 people, and mortality during 1996. Data were collected from Eucan — a service that provides data on the incidence and mortality of 24 key cancers in 15 member states of the European Union2. a Incidence rates of colorectal cancer Villus Lamina propria Cell shedding Differentiation and migration 24-48 hr Mitotic renewal # 24-36 hr , Crypt-villus junction Differentiated cells Goblet Entero- Absorptive cells endocrine epithelial cells cells 9» f Proliferative progenitors Stem cell Paneth cell Fig. 1. The anatomy of the small intestinal epithelium. The epithelium is shaped into crypts and villi (left). The lineage scheme (right) depicts the stem cell the transit-amplifying cells, and the two differentiated branches. The right branch constitutes the enterocyte Lineage; the [eft is the secretory Lineage. Relative positions aiong the crypt-viiius axis correspond to the schematic graph of the crypt in the center. Apical surface Direction of migration Basal surface Lamina propria muscularis externa J Spontaneous apoptosis Zone of differentiation Zone of proliferation Epithelial/ mesenchymal interactions Lymph nodule Sub-mucosa Homeostáza ve tkáních je udržována integrovaným systémem komunikačních mechanismů (mimo-, vnitro- a mezibuněčných) a reguluje chování buněk především s ohledem na schopnost proliferace, diferenciace, adaptivní odpovědi a apoptózy. Iniciované preneoplastické buňky jsou udržovány v latentním stavu v důsledku působení těchto "přirozených" regulačních mechanismů. V podpůrné (promoční) fázi rozvoje nádorů se uplatňují látky působící negenotoxickými (nebo epigenetickými) mechanismy, tzv. nádorové promotory, které způsobují změny chování buněk v důsledku deregulace zmíněných procesů. Zásahy, které vedou ke změnám v expresi genů a k poruchám homeostázy se odehrávají v buňce na různých úrovních a různými mechanismy. Střevní krypta a profil růstových faktorů ♦ kontinuálně se obnovující buněčné populace ♦ řada zásadních fyziologických funkcí ♦ dynamická rovnováha mezi přírůstkem buněk na bázi krypty (proliferace) a úbytkem (apoptóza-anoikis) na povrchu ♦ regulace endogenními faktory (hormones and cytokines), ale rovněž složkami diety přítomnými v lumen střeva DIFFERENTIATION APOPTOSIS (anoikis) PROLIFERATE Fully differentiated terminal ni', Pro! ife rati ng /d ifferenti ating cells Stem cells APOPTOSIS (damaged cells) Endogenous regulators O REPLICATION STAGES O O o kmenové buňky Signal transduction pathways associated with ANOIKIS Loss of cell anchorage No survival signals caspase-2 caspase-9 caspase-8 caspase-7] orP cytochrome -c caspase-10 J caspasa-1 DNA-fragmentation — cell death „Survival signalling pathways" aktivované při kontaktu buňka-buňka a buňka - ECM Grossmann J., Apoptosis 7, 2002 Přenos signálů po ztrátě kontaktu vedoucí k indukci anoikis INICIACE MUTAGENY RADIACE VIRUSY.... GENOTOXICITA PROMOCE NEGENOTOXICKÉ KARCINOGENY PROGRESE GENOTOXICKÉ +NEGENOTOXICKÉ FAKTORY NORMÁLNI BUŇKA INICIOVANÁ . BUŇKA PRENEOPLASTICKÉ PORUCHY MALIGNÍ NÁDOR INVAZE METASTÁZY AKTIVACE PROTO-ONKOGENU INAKTIVACE NÁDOROVĚ SUPRESOR. GENU INAKTIVACE ANTIMETASTAT. GENU Mnohostupňový proces karcinogeneze Vliv narušení (stimulace/inhibice) průběhu apoptózy v rámci procesu vícestupňové karcinogeneze Karcinogeneze však znamená víc než jen mutagenezi Kromě genových a chromozomálních mutací (genotoxicita) zahrnuje i NEGENOTOXICKOU SLOŽKU (EPIGENETICKÉ DĚJE) změny v expresi genetické informace na transkripční, translační nebo postranslační úrovni Geny jsou zapínány a vypínány ► během vývoje ► během buněčného cyklu, když buňka proliferuje ► když buňka diferencuje ► když je diferencovaná buňka stimulována k adaptivní odpovědi Iniciovaná kmenová buňka je_omezena v dalším růstu okolními normálními buňkami. Po expozici nádorovým promotorem nebo promočními podmínkami (buněčná smrt nebo odstranění buněk) suprimující účinek okolních buněk prostřednictvím kontaktní inhibice mizí. Hlavní mechanismy charakterizující negenotoxickou karcinogenezi ■ ovlivnění mechanismů signálové transdukce ■ aktivace specifických receptorů ■ produkce reaktivních kyslíkových radikálů (ROS, RNS) ■ změny GJIC ■ změny v metylaci DNA nebo v acetylaci histonů ■ ovlivnění exprese onkogenů, nádorově supresorových genů a genů buněčného cyklu ■ změny buněčného cyklu ■ změny proliferace (regenerativní nebo mitogenní) ■ změny v apoptóze ■ změny v rovnováze vyúsťující ve změnu obratu buněk ve tkáni VYZIVA hraje roli při vzniku v aterosklerózy, nádorů a řady dalších onemocnění. Mechanismy jsou předmětem výzkumu Je prokázáno, že vysoký příjem kalorií a tvorba tukových zásob je rizikovým faktorem. Příjem, absorpce a metabolismus velkého množství potravy vyžaduje oxidativní metabolismus a produkuje více reaktivních kyslíkových radikálů, které poškozují DNA. Ukázalo se, že příjem tuků, zejména živočišných zvyšuje riziko aterosklerózy a nádorů. Epidemiologické studie předpokládají pozitivní korelaci mezi příjmem tuků a nádory prsu, kolonu a prostaty. Navzdory dlouhé historii studií tuků a nádorů, zůstává řada protikladů. Ukazuje se, že nejen kvantita, ale i kvalita tuků hraje důležitou roli, a že se zde uplatňují i rostlinné oleje a rybí olej, zejména vysoce nenasycené mastné kyseliny (VNMK, PUFAs) tříd n-3 a n-6 Figure 1. Nutrient-genome interactions. Nutritional genomics encompasses both nutrigenetics, the influence of genetic variation on nutrient utilization/metabolism, food tolerances, and nutrient requirements; and nutrigenomics, the modulatory role of nutrients on genome evolution, mutation rate, in-utero viability, programming, and expression. In turn, several of the nutrigenomic outcomes (ie, genome evolution) contribute to the genetic variation observed within genetically diverse human populations. NOTE: This figure is available online at www.adajournal. org as part of a PowerPoint presentation. Stover PJ, J Am Diet Assoc 2008 Zdroje tuků živočišné a rostlinné Mastné kyseliny s krátkým řetězcem - 6-12 C (SCFA) kys. máselná,propionová nasycené - 12 a více C kys. palmitová, stearová mononenasycené -16 a 18 C, 1 dvojná vazba kys. palmitoolejová, olejová polynenasycené (PUFA) - 18 a více C, 2 a více dvojných vazeb kys linoleová, alfa-linolenová - esenciální MK Změny membránových fosfolipidů přímo ovlivňují syntézu lipidových mediátorů typu eikosanoidů, PAF a sekundárních přenašečů diacylglycerolu a ceramidu. Lipidové mediatory ovlivňují produkci a funkci cytokinů. To má důležitý dopad na řadu imunitních a buněčných funkcí včetně proliferace, diferenciace a apoptózy Imbalance v lipidovém metabolismu hraje roli u mnoha závažných onemocnění ► Vysoká hladina cholesterolu je spojena s kardiovaskulárními chorobami, které jsou nejčastější příčinou úmrtí v populaci. ► Lipidy produkované buňkami imunitního systému jsou zahrnuty v zánětlivých onemocněních jako je revmatoidní artritida, sepse, astma, zánětlivé onemocnění střeva. ► Lipidy hrají úlohu také v psychických a neurodegenerativních onemocněních (deprese, schizofrenie, Alzheimerova choroba) ► Lipidy ovlivňují počátek a rozvoj nádorových onemocnění Relativní procento různých mastných kyselin v potravě a změny způsobené průmyslovým zpracováním potravin Hunter Gatherer | Agricultural | Industrial 40 E I en o u o u Vitamin C -4 x I0fl Min -1-110,000 1,300 Years !!! 1,900 2,000 Fig. L. Hypothetical scheme of fat, fatty acid (u>6, 3, trans and total) intake (as percentage of calories from fat) and intake of vitamins E and C (mg/d). Data were extrapolated from cross-sectional analyses of contemporary hunter-gatherer populations and from longitudinal observations and their putative changes during the preceding 100 years [75]. VYSOCE NENASYCENÉ MASTNE KYSELINY (Polyunsaturated fatty acids - PUFAs) - mastné kyseliny s 2 i více dvojnými vazbami. Tři hlavní skupiny PUFAs: n-3 (omega-3), n-6 a n-9, podle polohy dvojné vazby nejbližší ke koncovému metylovanému uhlíku. Tyto jsou metabolizovány stejným způsobem alternativními desaturačními a elongačními enzymy. NOMENKLATURA: Např. kyselina arachidonová, 20:4, n-6 20 - počet uhlíků 4 - počet konjugovaných dvojných vazeb n-6 - poloha první dvojné vazby od metylovaného konce molekuly Téměř všechny dvojné vazby jsou ve víceméně stabilní cis - konfiguraci. Živočichové nedovedou syntetizovat n-3 a n-6 PUFAs de novo ani nedovedou přeměnit jednu sérii v druhou. Tyto ESENCIÁLNÍ MASTNÉ KYSELINY musí být obsaženy v potravě podobně jako vitamíny. Jsou životně důležité jako složka všech membrán a permeabilní bariéry pokožky a jako prekursory eikosanoidů a s nimi souvisejících látek, které hrají důležitou regulační úlohu ve tkáních. Zdrojem jsou rostlinné oleje (n-6 PUFA) a rybí olej (n-3 PUFA) VYSOCE NENASYCENÉ MASTNÉ KYSELINY (VNMK) (Polyunsaturated fatty acids - PUFAs) - mastné kyseliny s 2 i více dvojnými vazbami. Esenciální prekurzorové kyseliny řady n-6 a n-3 CIWww\AM rostl.oleje 18:2n-ó COOH CH, COOH Linoleic acid —4— 18:3n-6 CH, "Wwwwwv \ TS.6 desaturase Elongase COOH 20:3n-6 Dihomo-y-linolenic acid (DCiLA) A5 desaturase CH, c:ooh I 20:4n-6 Arachidonic acid (AA) 18:4n-3 i 20:4n-3 i 20:5n-3 Eicosapenlaenoic acid (EPA) , /WVWWWV\ ■^i' COOJI 22:4n-6 22:5n-3 J Elongase, M desaturase and |ľybí olej i \ peroxisomal ^-oxidation i c:ooh 22:6n-3 /WWWWWWV 22;5n-6 Doeosapenlaenoic acid (DPA) ^ Docosahexaenoic acid (DHA) COOH jji. n-6 series n-3 series C1 WVAMW C6 wwwww wwww\wvc Series 2 eicosanoids (i.e. PGE2P Series 4 leukotrienes (i.e LTB4) COXaLOX wwww\a/ VvVWWWW/ wwwwwi. + 0 o II H3C-C-SCoA C3 / L n A 01 v^aaaaaA^ A6 desaturation ^ 18:3 18:4 . elongation 20:3 20:4 JtL A5 desaturation VQV=V=V=W\(/U VeVcVaVB\AAA7, C-18:1ra7 C-1S:1ra9 O 20:5ra3 3 22:Sg£ 22:4w6 22:6w30n _2QJmfl 20:4«6 < 18:3w3 1.0 -■ n=329 20:3(i>6 O Saturates ° Monounsaturates O Omega-6 o Omega-3 I.O 0.5 High risk of breast cancer (Figure 3. Principal component analysis of adipose tissue fatty acids. In the scatter plot of the second principal component against the first principal component (in which theX axis represents the first principal component and the Faxis represents the second principal component), the (coordinates of each fatty acid equals the coefficients of correlation between the fatty acid and the principal components. The unity correlation Icircle drawn defines the limits in which the fatty acids locate: the closer a fatty acid to this unity circle, the higher its contribution to the Idcfinition of the principal components. The uj6/(jj3 ratio is located as illustrative variables—i.e., it does not contribute to the definition of the Iprincipal components, but it is positioned in the scatter plot according to its correlation with the two principal components. Red arrow, increased Irisk of breast cancer, taking into account the OR associated with both the X and Faxis, adjusted for BMI, age, menopausal status, and height. JThe position of this arrow is almost superposed on the Kaxis because the OR associated with the first component is close to 1, whereas the OR lassoeiated with the second principal component is 1.28 (95% CI, 1.11-1.49; P - 0.001). (Bougnoux P. et al, Diet, Cancer and Lipidome Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 15, 2006) Analýza (array) hladiny MK u benigních a maligních nádorů prsu Cases Controls ■ii ni ii minim muiinim iiimiiinmjliTiijfliiiiii iiimiii iiiiiik^ Změny spektra MK v tukové tkáni krys po podávání alfa-linolenové a dokosahexaenové kyseliny WAT - white adipose tissue MOLEKULÁRNÍ MECHANISMY působení w-3 VNMK ► změny vlastností buněčných membrán (fluidita, lipidové rafty) suprese biosyntézy eikosanoidů odvozených od AA- změna imunitní odpovědi a modulace zánětu, proliferace, apoptózy, tvorby metastáz a angiogeneze ovlivnění signálové transdukce, aktivity transkripčních faktorů (NFkB, PPARy) a genové exprese - změny metabolismu, buněčného růstu a diferenciace ► změny metabolismu estrogenů - redukce estrogeny stimulovaného růstu ► zvýšená nebo snížená produkce volných radikálů (kyslíku, dusíku) ► mechanismy zahrnující citlivost k insulinu Složky lipidového metabolismu v buněčných signalizacích Mediátory a modulátory SIGNÁL (např. cytokiny) Biofyzikální vlastnosti membrán Lipidový metabolismus Aktivace fosfolipáz Uvolňování a metabolizace AA eikosanoidy vnitrobuněčné funkce Transdukce signálů (kinázy, fosfatázy) Aktivace membrán. i vnitrobun. receptorů - tr. faktorů Exprese proteinů Exprese genů - mRNA : i | proteiny jaderné receptory transkripční faktory (NFkB, PPAR, AP-1...) / mRNA í NOS . | DNA genová exprese l l eikosanoidy :>vá _L dace / \ \ -1 LOX P450 COX membránové fosfolipidy —; orelace s cytokinetikou Posloupnost dějů Phospholipid structure and the orientation of phospholipids in membrane /polarX hydrophilic group head hosphatje 1 water glycerol 1 vl lilxyIIyMyxI IMx\ PhosPhol'P'^ '—* 1 IwLl V ll*>l a! Mvl bilayer, two hydrophobic fatty acid fatty aci fatty aci i lM n Innhnllnhnl Inl or mem°rane tails \ \ phospholipid molecule Figure 2-22. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. 17996541 Extracellular fatty acid carrier albumin diffusion "flip-flop" I I Fatty acid transporter and activator? 6 mammalian genes fatty acid transport protein fatty acid binding protein protein mediated CoA acyl CoA OoA synthetase CoA CoA 9+ mammalian genes 5 mammalian genes Intracellular Activates fatty acid carrier fatty acid Proposed models tor FA internalization in neurons. In the diffusion model of FA internalization, F\s are released from albumin and, owing to their hydrophobicity, partition into the outer leaflet of the plasma membrane. The F\s then "flip-flop" from the outer leaflet to the inner leaflet of the plasma membrane, where they can dissociate or be extracted by FABPs or Ac si proteins. F\s bound to FABPs are ultimately transferred to Acsl proteins, which catalyze the reaction that converts the free FAs to their CoA derivative. The FA-CoA cannot repartition into the membrane owing to the presence of the hydrophilic CoA Additionally, FA internalization may be mediated by FATPs. FATPs may increase the rate or efficiency of FA "flip-flop" or increase FA stability in the inner leaflet, which increases the opportunity for F\s to interact with either FABPs or Acsl proteins. It remains controversial whether FATPs themselves convert the FAs to their FA-CoA derivative. FATTY ACID TRANSLOCASE (FAT/CD36) Protein v plasmatické (mitochondriální?) membráně CD36 - multifunkční adhezní receptor pro trombospodin a kolagen a scavenger receptor pro LDL exprimovaný na plateletech, monocytech ale i jiných typech buněk. Nově prokázána funkce při transportu VNMK i jeho přítomnost v buňkách gastrointestinálního traktu (Lobo MVT et al., J Histochem Cytochem 2001, Campbell SE et al, J Biol Chem 2004, Drover VA, J Clin Invest 2005) Extracellular Intracellular Fig. 1. Schematic representation ol the membrane topology of fatty acid (FA) transport protein. Pohl J et al., Proc Nutr Soc, 2004 Expression of CD36 antigen in HCT116 cells after treatment with AA, DHA, NaBt or their combinations membrane bilayer 4' Phospholipase A2 Prostaglandins Leukotrienes and Eicosanoids series 1 Lipoxins series 4 series 2 Eicosanoids series 3 Leukotrienes and Lipoxins series 5 Fosfolipáza A2 Enzym účastnící se lipidového metabolismu, důležitý pro řadu buněčných procesů. Tři skupiny: ► sekretovaná PLA2 (sPLA2), ► na vápníku nezávislá PLA2 (iPLA2), ► na vápníku závislá cytosolová PLA2 (cPLA2). Kromě úlohy v buněčném signálování souvisejí PLA2 s různými patologickými stavy, včetně zánětu, tkáňové reparace a nádorů. U řady nádorů jsou hladiny sPLA2 a cPLA2 zvýšeny. PLA2 jsou také cílem protinádorové terapie sPLA2 v zánětlivé odpovědi Prozánětlivé cytokiny indukují expresi sPLA2. Aktivační faktory uvolňují sPLA2 ze sekrečních granul do ECM. Za přítomnosti Ca2+ sPLA2 hydrolyzuje membránové fosfolipidy sousedních buněk. Uvolnění AA a následná tvorba eikosanoidů indukuje zánět. Extracellular matrix Drug Discovery Today Figure 2. sPLA2 participating in an inflammatory response. (1) Pro-inflammatory cytokines such as tumour necrosis factor a (TNF-a) or interleukin 1Ji (IL-1J5) induce cellular expression ot sPLA2. (2) Activating factors cause release ot sPLA2 from secretory granules into the extracellular matrix. (3) In the presence of millimolar concentrations ot Ca2+, sPLA2 hydrolyzes membrane-bound phospholipids ot neighbouring cells. Released tatty acids, such asarachidonic acid, are further metabolized into eicosanoids, generating an inflammatory response in neighbouring cells. Extracellular matrix Pro-inflammatory Activating stimuli Drug Discov&ry Today Figure 3. Activation of cPLA2-oc. (1) Pro-inflammatory cytokines including tumour necrosis factor or induce expression of cPLA2-ot. (2) Activation leads to mitogen-activated protein kinase-pathway-directed phosphorylation of cPLA2 -tx. (3) Extracellular influx or mobilization of intracellular stores of Ca2+ bring about cPLA2-ot translocation from the cytosol to perinuclear membranes. This brings cPLA2-o: in close proximity to both its substrate and enzymes involved with eicosanoid synthesis. (4) Activated cPLA2-ot lyses membrane phospholipids providing arachidonic acid (AA) to a range of enzymes involved with eicosanoid synthesis, specifically COX and LOX. Aktivace cPLA2 Prozánětlivé cytokiny indukují expresi cPLA2. Následuje fosforylace zprostředkovaná MAP kinázami. Ca2+ způsobuje translokaci cPLA2 z cytosolu do perinukleární membrány, kde je také její substrát a enzymy nutné k tvorbě eikosanoidů. Aktivovaná cPLA2 lyzuje membránové fosfolipidy a uvolňuje AA, která je metabolizovaná COX a LOX. Model konstitutivni overexprese cPLA2 a COX-2 u nädorovych bunek Pro-inflammatory cytokine ~< (e.g.TNF-a) Drug Discovery Today Figure 4. Model of constitutive overexpression of cPLA2 and COX-2 in tumour cells (reviewed in [4]). Interakce n-3 PUFAs s AA při syntéze eikosanoidů s prozánětlivou aktivitou kyselina linoleová (LA) (18:2 n-6) kyselina linolenová (LNA) (18:3 n-3) metabolismus DIETA metabolismus kyselina arachidonová (AA) (20:4 n-6) kyselina eikosapentaenová (EPA) (20:5 n-3) TXA2 PGE2 LTB4, LTC4, LTD4 faktor agregace destiček mediátory zánětu TXA3 PGE3 LTB5, LTC5, LTD5 slabší faktor agregace destiček slabší zánětlivá aktivita Cyklooxygenázové dráhy kyselina arachidonová COX-1 konstitutivní žaludek střevo ledviny krevní destičky COX-2 indukovatelná místa zánětu - makrofágy - synoviální buňky aktivace inhibice endotoxin cytokiny mitogeny glukokortikoidy selektivní inhibitor COX-2 Cef} surface Fig. 5. The EP1 receplor signals via counling lo an eis yel unchLiniclerised G prolein. The blocked ittüw indicales ihe pulenlia] inhibilory efTecl on FGE2 signtiHing ihrough rd varianl EP1 receploT such as fbund in ihe nil (see le\l). EP2 Signalling EP4 Signalling Prenos signälü PGE2 prostrednictvim receptorü EP1 - 4 110 £ Chell et al. !Biochimica et Biophysica Acta 1766 (2006) 104-119 PGH2 Prostaglandin E Synihases FPf Signalling EPJ Signalling * EP2 S^nalting X, SP4 Signalling PKA pERK Akt Fig. 4. PGE;can signal through any single (or combination of)EP receptor. Signalling depends upon ihe enzymatic machinery and receptors present in Ihe tissue or cell type in question. Signalling via the EP1 Teceplor subtype activates IP3 and mobilises intracellular Ca:+, through an asyel uncharacleTised G protein [110]. The EP2 and EP4 Teceptors activate adenylyl cyclase activity through binding Gs proteins (EP4 also has the capacity to modulate M APK signal cascades). The predominant EP3 receptor splice variant (of which four have been identified in humans) induces the inhibition of adenylyl cyclase, and hence inhibits cAMP activation, although this receptor subtype can also couple to Gs and G12. Arrows indicate activation by phosphorylation, whereas blocked arrows indicate inhibition of activation. COX-2 i 5-LPO stimulují buněčnou proliferaci, inhibují apoptózu a indukují neoangiogenezi Table 1. COX2 expression in malignant or premalignant human tumours Premalignant or malignant lesion COX2 expression (%) Colorectal 60-90 Gastric SO Oesophageal 70 Hepatocellular (liver cirrhosis) 54(81) Pancreatic 67 Head and neck 80 Non-srnall-cell lung cancer 70 Breast (ductal carclnoma-ln-sltu) 40 (60) Prostatic 88-93 Bladder 86 Cervix 43 Endometrial 37 Cutaneous basal cell 25 Cutaneous squamous cell 80 pPNET 100 Glioblastoma multiforme 71-74 Anaplastic astrocytoma (low grade) 44(30) References available at http://lmage.thelancet,com/aytras/03oncl205webfr.rjdf log CECM ratio, COX-2/1) L- o _i_ _I lumiracoxib rofecoxib etcricoxib valdecoxib do do lac meloxicam nimesulide celecoxib diclofenac sulindac meclofenamate tomoxiprol I diflunisal sodium salicylate niflumic zomepirac fenoprofen amp yr one ibuprofen tolmetin naproxen aspirin indomethacin ketoproten suprofen flurbiprofen ketorolac o « Mechanismy účinků exprese COX-2 na vývoj kolorektálních nádorů: Účinky nezávislé na produkci prostaglandinů (PGE2): Aktivace karcinogenů Produkce malondialdehydu Redukce hladiny volné AA Účinky závislé na produkci PGE2: Indukce buněčné proliferace Inhibice apoptózy Indukce angiogeneze Zvýšení buněčné motility Zvýšené metastatického potenciálu Indukce lokální imunosuprese Model interakce mezi nádorovými buňkami, endoteliálními buňkami a infiltrujúcimi zánětlivými buňkami v místě nádoru _Úloha COX-2, PG a prozánětlivých molekul v angiogenezi_ t Angiogenesis factor secretion T COX-2 and PG production t antí-apoptotic factors how much ? ^Frorvi constitutive low expression of COX-1 from all cell types -From transient high expression COX-2 from inflammatory cells and tumor cells. Prostaglandin m pool Angiogenesis factors T Migration t Permeability ľ Neovascular formation -positive feedbacks increase the secretion of pro-inflammatory molecules Fig, 1. COX-2 in angiogenesis. This figure models the interactive relationship among cancer cells, endothelial cells and infiltrating inflammatory cells at the site of rumori gene sis. The prostaglandin pool is contributed to by all three different cell types and occasionally stromal cells. The positive feedback through prostaglandin receptors increases COX-2 expression and ensures the continued generation of prostaglandins, hi the cancer cell, prostaglandin signaling also results in the production of multiple angiogenesis factors, through which they stimulate neovascular formation at the site of tumorigencsis, hi inflammatory cells, prostaglandin signaling stimulates the gene ration of proinflammatory molecules such as IL-2, which further recruits additional circulating monocytes and amplifies the inflammatory response. As a response to inc leased levels of prostaglandins, angiogenesis factors and pro-inflammatory molecules, endothelial cells proliferate, migrate and undergo tubal formation, providing additional nutrients for oncogenesis as well as a potential route for metastasis. ÚČINKY INHIBICE CYKLOOXYGENÁZ NÁDOROVÉ BUN. A LIPOXYGENÁZ NA POPULACE • Řada nádorů má změněný metabolismus nenasycených MK a produkuje zvýšené množství metabolitů AA, které indukují růst a invazivitu (epiteliální nádory - prsu, kolonu, plic, prostaty) • Frekvence exprese jednotlivých typů enzymů (COX1, COX2, 5-, 12-15- LOX, FLAP, P450) se liší podle typu a histologického stupně nádoru • Mitogenní a viabilitní faktory (EGF, HGF atd.) a prozánětlivé cytokiny (TNF-a, IL-1) indukují uvolňování AA a tvorbu eikosanoidů, které slouží jako přenašeče nebo modulátory signálů regulujících proliferaci a apoptózu • Nesteroidní antiflogistika (NSAID - aspirin, sulindac, indometacin, ibuprofen , piroxicam) inhibují aktivitu COX a mají preventivní a terapeutické účinky na rozvoj nádorů, zejména kolonu - využití inhibitorů COX2 (inducibilní) • NSAID - snižují proliferaci a indukují apoptózu mechanismy závislými i nezásvislými na aktivitě COX • Účinky mohou být přímé nebo nepřímé - zprotředkované např. změnami aktivity imunitního systému • Inhibitory LOX (NDGA, esculetin, MK-886) inhibují proliferaci a indukují apoptózu řady nádorových línií • Produkty 5-LOX fungují jako „second messengers" řady růstových a viabilitních faktorů • Produkty 12-LOX se uplatňují v procesu invaze a tvorby metastáz - ovlivnění exprese proteáz, adhezívních molekul - využití inhibitorů Molekulärni mechanismy COX-2 a NSAIDs Cell membrane Fig, 4, Molecular mechanisms for COX-2 and NSAIDs, The right part of the model illustrates the prostaglandin synthesis pathway as well as the subsequent receptor signaling—the specific prostaglandin receptors as well as tlx; non-canonical ECF receptor pathway. As the result of inhibiting COX enzymes, accumulation of arachadonic acid would directly promote apoptosis and attenuation of positive feedback to proliferation and survival through receptors. The rest of the figure demonstrates several COX-2 independent mechanisms proposed for NSAIDs, Since, not all NSAIDs arc able to act through these mechanisms in every cell type, a brief table is attached to summarize the particular NSAIDs used in each experiment as well as tIk cell lines involved. Microarray analýza CaCo-2 buněk po působení DHA (48h) Narayanan BA et al., Cancer Res 2003 COX-2* n Other + Prolnflamrnatory Genes Potenciální molekulární mechanismy působení DHA na nádorové buňky kolonu Narayanan BA et al., Cancer Res 2003 Peroxisome proliferators (fibrates, phtalates, etc.).. 9-c/s-RA Nutrition Fatty acids (PGJ2, LTB4) PPArQ^^^RXR iPPRE^/X/l Target genes Transcription_> CELL SPECIFIC RESPONSES * Proliferation Differentiation and maturation Apoptosis + MEDICAL RELEVANCE * Clonal expansion of preadipocytes promoting adipogenesis (participation on PPARy.) * Hypothetical risk in man of cell growth stimulation by activation of PPARs. * Monocyte / macro-phage differentiation (implication of PPARy) leading to accelerated atherosclerosis. * Protective effects of PPARa. * Adipocyte differentiation responsible of obesity and other related disorders (implication of PPARa.) * Enhanced PPARg expression could lead to tumoral cell apoptosis and represents a therapeutical approach in malignant disease. Importance of PPARs in cell proliferation, differentiation and apoptosis. After activation, PPAR and RXR form heterodimers which bind to DNA regulatory sequences of target genes through interaction with PPRE. The control by PPARs of the transcriptional activity af target genes gives rise to biological effects which may have consequences for human health. LTB4, leukotriene B4; PGJ2, prostagladin J2; PP, peroxisome proliferator; PPAR, peroxisome prolifera-tor-activated receptor; PPRE, peroxisome proliferator responsive element; 9-cis-RA, 9-cis-retinoic acid; RXR, 9-cis-retinoic acid receptor. PP VLÁKNINA Table 1. Possible mechanisms for the protective action of dietary fibre on colorectal oncogenesis Physical Increased bulk and dilution of carcinogen Decreased contact time due to more rapid transit Binding of carcinogen Binding of bile salts Pre hi otic and metabolic action of flora Alteration of colonic microflora; numbers and species balance Inhibition of carcinogen activation Stimulation of flora to increase bulk Alteration of bile salt metabolism to reduce conversion to secondary bile salts Fermentative Lowering of pH Reduced solubility of bile salts Increased production of SCFAs, especially butyrate Metabolic Reduced insulin resistance and hyperinsulinaemia stné kyseliny s krátkým řetězcem- BUTYRÁT OH ► produkován anaerobní mikrobiální fermentací vlákniny ve střevě zdroj energie pro normální kolonocyty ► významný pro udržení homeostázy ve střevní tkáni regulací exprese genů spojených s regulací proliferace, diferenciace a apoptózy (microarray analýza - změny exprese 19 400 genů), exportní protein MCT1 ► butyrát sodný (NaBt) snižuje proliferaci a indukuje diferenciaci a apoptózu neoplastických kolonocytů in vitro a in vivo Prevence NÁDORŮ TLUSTÉHO STŘEVA The effects of butyrate in the colon epithelial cells during adenoma-carcinoma transition Účinky butyrátu na nádorové buňky: Inhibice proliferace - blok v G1 nebo G2/M, indukce p21, Cyklin D1,D3, downregulace c-myc Indukce diferenciace a apoptózy - genové arrays Inhibitor histon deacetyláz - změny exprese genů Ovlivnění specif. kináz, aktivace PPAR gamma, inhibice NFkB Inhibice c-Src, FAK, iNOS, COX-2 Short-chain fatty acids S Fig. 4. Overview of the different pathways leading to inhibition of cell proliferation and the blocking of the G1 stage of the cell cycle (for details, see p. 104). NF-kB, nuclear factor kappa B; Rb, retinoblastoma protein; cdk, cyclin-dependent kinases; p21/cip1, a member of the Cip/Kip family which bind to the cyclin-cdk complex to inhibit its activity; Tob1 (APR06), a member of the antiproliferative family APRO, members of which control cyclin D1 transcription. Blottiere HM et al., Proc.Nutr. Soc. 2003 IPIDOVE SLOŽKY VYZIVY VICE, NEZLÍ JEN ZDROJ ENERGIE!!!! ♦ strukturální a regulační úloha ♦ dopad na fyziologické funkce organizmu účinky na imunitní systém regulace proliferace, diferenciace a apoptózy ► úloha v karcinogenezi (etiologie nádorů tlustého střeva, prostaty, prsu) kaboratory [•jytokinetics Spolu s cytokiny a hormony fungují jako intra- i intercelulární mediátory a modulátory buněčné signalizační sítě Poměr obsahu co-6 a co-3 esenciálních vysoce nenasycených mastných kyselin (VNMK) ovlivňuje vlastnosti membrán, zejména jejich fluiditu a produkci látek vznikajících hydrolýzou membránových fosfolipidů. Tyto změny pak ovlivňují vazbu cytokinů, aktivitu receptorů i funkci na membránu vázaných signálních molekul (G proteinů, fosfolipáz atd.). Patologické změny v produkci a funkci cytokinů a eikosanoidů přispívají k rozvoji nádorových onemocnění zejména ovlivněním imunitního systému a buněčné kinetiky Metabolismus a obrat fosfolipidů v membránách i oxidativní metabolismus nádorových buněk se zásadně liší od buněk nenádorových. Nádorové buňky kolonu vykazují: ♦ změny ve spektru a koncentraci VNMK ve srovnání s normální tkání ♦ zvýšenou periferní utilizaci VNMK z potravy ♦ změny v oxidativním metabolismu a antioxidační ochraně ♦ zvýšenou aktivitu enzymů metabolismu kys. arachidonové (COX2, 12-LPO...) a produkci eikosanoidů ♦ sníženou citlivost k endogenním inhibitorům růstu (TGF-ß1), induktorům apoptózy (TNFa, FasL, TRAIL) a diferenciace (butyrát) CYTOKINY Důležité endogenní faktory ovlivňující kolorektální karcinogenezi TNF-family (TNF-a, Fas ligand, TRAIL - TNF relating apoptosis inducing factor) TGF-family (TGF-p) EGF - epidermální růstový faktor Tumour necrosis factor-alpha (TNF- a), interleukiny ► multifunkční cytokin ► jeden z hlavních mediátorů zánětu ► TNF- a je produkován makrofágy a dalšími buňkami imunitníhp systému ► koncentrace TNF- a v kolonu je zvýšena během chronického zánětu (ulcerativní kolitida nebo Crohnova choroba) ► úloha v nádorové kachexii ► existuje interakce mezi cytokiny a dietetickými faktory - mastné kyseliny a eikosanoidy výživový status proteiny lipidy vitamíny minerály infekce zánět neoplazie produkce a uvolňováni cytokinů PG LT atd. biologická funkce cytokinů imunitní odpověď odpověď akutní fáze horečka anorexie změněný metabolismus lipidové mediatory Vzájemné vztahy mezi výživou a infekčními a zánětlivými chorobami zprostředkovanými cytokiny ZMENY BIOFYZIKALNICH VLASTNOSTI BUNĚČNÝCH MEMBRAN ► provázejí procesy diferenciace a apoptózy savčích buněk ► pozorovány rozdíly u • nádorových a normálních buněk • nádorových buněk senzitivních a rezistentních k cytostatikám ► souvisejí do značné míry s modulacemi ve složení, struktuře, symetrii a metabolismu buněčných lipidů. Detekce těchto změn a jejich korelace s dalšími parametry odrážejícími diferenciaci a apoptózu přispívá k objasnění • posloupnosti a regulace jednotlivých kroků těchto dějů • rozdílů mezi normálními a nádorovými buňkami • příčin rezistence nádorových buněk k terapii PARAMETRY DETEKOVANÉ v LC ♦ strukturální změny lipidů v bun. membránách, tzv. „lipid packing" (merocyanine 540, FCM) ♦ membránový potenciál (DiOC5, FCM) ♦exprese transportního proteinu pro mastné kyseliny - FAT/CD36, MCT1 (FCM) ♦akumulace triglyceridů (lipid droplets) v cytoplazmě buněk (Nile red, FCM) ♦ změny mitochondriálního transmembránového potenciálu (TMRE, FCM) ♦produkce reaktivních kyslíkových metabolitů -ROS (DHR-123, FCM) CYTOKINETIKA Proliferace - počty buněk, buněčný cyklus, regulační proteiny Diferenciace - aktivita alkalické fosfatázy (ALP), CEA, E-kadherin, F-aktin Buněčná smrt (apoptóza)-viabilita, % plov.buněk, subG0/G1, MMP, Apo2.7, kaspázy, štěpení PARP, Bcl-2 rodina, morfologie jader (DAPI)... METODOLOGIE CYTOKINETIKA Detekce proliferace- regulace buněčného cyklu a zapojených proteinů, diferenciace -buněčná morfologie, aktivita specifických enzymů, exprese specifických proteinů apoptózy -detekce charakteristických změn na úrovni jádra, mitochondrií, membrán, cytoskeletu, exprese regulačních proteinů, štěpení specifických enzymů a substrátů ZMĚNY LIPIDOVÉHO METABOLISMU A VLASTNOSTÍ BUNĚČNÝCH MEMBRÁN -změny spektra MK v bun. lipidech, „lipid packing" v membránách, akumulace triglyceridů, detekce kardiolipinu, membránový potenciál ZMĚNY OXIDATIVNÍHO METABOLISMU - produkce reaktivních metabolitů kyslíku (ROS) a dusíku, lipidová peroxidace, účinky antioxidantů Využití moderních metod průtokové cytometrie, fluorescenční mikroskopie, fluorimetrie, spektroskopie, metod molekulární biologie... Detekce apoptózy různými metodami Průtoková cytometrie Fluorimetrie Fluorescenční mikroskopie Western blotting • změny v uspořádání membránových lipidů (AnnexinV) • aktivita a štěpení kaspáz • štěpení substrátů kaspáz (PARP, cytokeratin 18) • exprese proteinů rodiny Bcl-2 • mitochondriální membránový potenciál • kondenzace a fragmentace jaderného chromatinu VÝSTUPY > Základní výzkum > Klinika a výrobní praxe protinádorová prevence a terapie oblast nutriční farmakologie optimalizace lipidových výživ pro určité diagnózy („disease specific nutrition"), zejména u pacientů s nádorovým onemocněním (Projekt cíleného výzkumu AV ČR - „Tukové složky výživy...) DALŠÍ PARAMETR ♦ Fluidita membrán - polarizace fluorescence TMA-DPH (trimethylammonium diphenylhexatriene) ♦ Analýza fosfolipidů a spektra mastných kyselin Celé buňky, membránová frakce, mitochondrie (kardiolipin) ♦Detekce specifických typů lipidových molekul (ceramid, eikosanoidy.......) ♦Lipidový metabolismus - inhibitory AA, exprese a aktivity spec. enzymů (PLA, COX, LOX,....), Oxidativní metabolismus - produkce ROS, NOS peroxidace lipidů, glutation, enzymové aktivity - iNOS, MnSOD atd. MEROCYANIN 540 (MC540) ► Lipofilní, negativně nabitý heterocyklický chromofor m. v. 570 D, používán ve fotodynamické terapii ► Váže se preferenčně na biologické membrány a lipozomy a je citlivý ke strukturálním změnám lipidů ► Rozsah vazby a následně intenzita fluorescence je ovlivňována • změnou tzv.„lipid packing" • membránovým potenciálem • přítomnosti séra, pH a iontovou silou YUŽITÍ MC54 Pomocí MC540 lze monitorovat ► strukturální změny membránových fosfolipidů (změny asymetrie) během proliferace, diferenciace a apoptózy ► jemné rozdíly membránových lipidů u podobných buněk (nádorové vs. nenádorové, senzitivní vs. rezistentní) FL-2 "looser lipid packing" (rozvolňování) zvýšená fluorescence "more tight packing" (upevňování) snížená fluorescence ► akumulace lipidových kapének (lipid droplets) v cytoplazmě buněk (působení lipidových látek, indukce diferenciace a apoptózy ) ► obsahují neutrální lipidy (obvykle triacylglyceroly nebo estery cholesterolu) za normálních podmínek - zásobárna energie a cholesterolu ► souvislost s regulací procesů diferenciace a apoptózy není zcela objasněna ► fluorescenční barvivo Nile Red (FL-1 a FL-3) citlivé vitální barvení lipidových kapének Box 2 I Intracellular cholesterol regulation Late endosome O o o Lipoprotein hydrolysis Low free cholesterol Cholesterol LDL receptor 3—LDL a Lipoprotein uptake Plasma membrane e Cholesterol efflux High free cholesterol Figure 11 The formation of lipid droplets, a | The formation of lipid droplets (LDs) as monitored by the use of a caveolin-truncation-mutant-green-fluorescent-protein fusion protein (Cav3DGV-GFP). Before fatty acid addition (t = 0 min). Cav3D0V-GFP Localizesto the endoplasmic reticulum (ER) and Colgi region (the image has been inverted to show dark staining forCFP). After fatty acid addition, LDs appear throughout the cell within minutes (thet = 30 min image is shown here}. Foramovieof this process, seethe Further information, b | In the current model of LD formation, neutral Lipids are synthesized between the Leaflets of the ER membrane. The mature LD is then thought to bud from the ER membrane to form an independent organelle that is bounded by a Limiting monolayer of phospholipids and LD-associated proteins. Some of the best understood LD-associated proteins are members of the PAT {perilipin. ADRP and TIP47-related proteinj-domain family of proteins. Part a modified with permission from REF. 8 © (2004) The American Society for Cell Biology. Structural Proteins Perilipin, ADRP, TIP 47 Membrane Trafficking Caveolin, SNAP, VAMP, small GTPases (e.g. Rab5, Rab18) Eicosanoid -forming enzymes PLA2, 5-LO, 15-LO COX, LTC4 synthase, PGES Lipid metabolism Squalene epoxidase Acetyl-Co A carboxylase Acyl CoA Synthetase Lanosterol synthase Triglyceride lipase Alcohol dehydrogenase Fatty acid CoA ligase S100A9 Cytokines/ Chemokines TNF-a RANTES/IL-15 bFGF Cell Signaling MAPs: ERK1, ERK2, p38 PI3K: subunits p55, p85a, p85b PKC Hg. 1. Lipid body-associated proteins. Control AA Akumulace lipid bodies (droplets v cytoplasmě buněk kolonu po přidání AA Moreira LS, Biochim Biophys Acta 2009 Kolokalizace lipid bodies (droplets) s cPLA2 a uvolňování AA u kolonových buněk po působení kyseliny olejové LIPIDOVÉ RAFTY malé oblasti proteinů a lipidů v membráně s unikátním složením lipidů - bohaté na cholesterol. Tyto struktury jsou funkčně zahrnuty v kompartmentalizaci, modulaci a integraci buněčných signálů a tak modulují důležité procesy jako buněčný růst, přežití a adhezi. VNMK jsou základní složkou lipidových raftů a předpokládá se, že např. DHA může částečně působit zvýšením fázové separace lipidů v membráně. Strukturální integrita LR a caveolae jsou základní pro příjem VNMK. Caveolin-1 a FAT/CD36 jsou vázány v LR Figure 2 | The Fluid-Mosaic-Model of ttie cell membrane. Like a mosaic, the cell membrane is a complex structure made up of many different parts, such as proteins, phospholipids and cholesterol. The relative amounts of these components vary from membrane to membrane, and the types of lipids in membranes can also vary, FreG eriGrgy is dirGctly proportional to tho boundary length Fig. 2 I Mismatch of hydrated phospholipids and the intercalation of cholesterol as a driving force for a phase separation into liquid-ordered and -disordered phases. (Figure courtesy of P. Kinnunen.) PC black, SM red, PLAP yellow. Atomic force microscopy! Lodish, Molecular Cell Biology, 5th ed. 2004 Modulace lipidú (DHA)- lipidové rafty - modulace signálu TNFR PmL Fas TCR FatL Non-raft FAD D Lipid raft McMKirneríc Foi Pm-aiiorialed Fat [Iyp.ll) (Tn>*ľj c/epíeŕroji Poor caipase activation No Cell Death Compose activation Cell Death B TNFR1 Non-raft clAF-1/V 'l/V^A V CompíejfJJ 0,0 - V> poor NF-kQ □ctí v □ lion Cell Death Blockode oF caspase-8 activation, Anti-apopfoiis, Inflammation Figure 2. Examples of How Lipid Rafts Can Modify Early Events In TNFR Family Signaling (A) In activated CD4+ T cells, Fas Is excluded from lipid rafts. Outside of lipid rafts, Fas Is likely to be monomerlc. After engagement by FasL, although FADD and caspase-ô are recruited to Fas, they do not signal efficiently for death. Upon TCR restlmulatlon, Fas translocates Into lipid rafts where It tends to preassoclate. Within lipid rafts, upon FasL binding, FADD and caspase-8 are recruited to Fas where caspase-8 can autoactivate and trigger cell death. (B) Upon TNF binding, TNFR1 translocates Into lipid rafts wherein complex I formation takes place and results In the activation of NF-kB. Through mechanisms described in Figure 1, NF-kB can Inhibit caspase activation within complex II. When cholesterol Is depleted, lipid raft structure Is disrupted and complex I forms outside of lipid rafts and cannot signal efficiently for NF-kB and therefore cannot Inhibit death induced by complex II. The thickness of the arrows indicates relative efficiency of each signaling pathway.