Změny aktivity transkripčního faktoru NF-kappaB ve vztahu k regulaci cytokinetiky Mgr. Jiřina Procházková, Ph.D. jipro@sci.muni.cz Osnova • Struktura NF-kappaB • Charakterizace členů rodiny NF-kappaB • Klasická vs. alternativní dráha aktivace • Transaktivace, ubiquitinace • NF-kappaB a apoptóza • NF-kappaB a imunitní systém • NF-kappaB a proliferace • NF-kappaB a stres • NF-kappaB a karcinogeneze • Metody detekce aktivního NF-kappaB NF-kappaB • Nuclear Factor – kappa B (NF-kB) - Jaderný faktor B lymfocytů, který se váže na enhancer pro gen kódující lehký k řetězec imunoglobulinů • Objeven v roce 1986 (Sen, Baltimore et al.) • Pro-přežití, pro-zánětlivý transkripční faktor • Aktivován min. 210 podněty a ovlivňuje transkripci min. 150 genů (Pahl 1999) • Úzká vazba na procesy proliferace, karcinogeneze, aktivace imunitního systému Struktura NF-kappaB Rodina NF-kappaB/IkappaB Dimerizace členů rodiny NF-kappaB NF-kappaB knock-outs Signálová dráha NF-kappaB Transaktivace Ubiquitin proteasomový systém • Ubiquitin – 76 Akys • E1- Ub. aktivující e. • E2- Ub. přenášející e. • E3- Ub. ligáza Kanonická dráha aktivace NF-kappaB Hlavní dimer p65/p50 Alternativní dráha aktivace NF-kappaB Dráhy aktivované TNF TNFa – prozánětlivý, proapoptotický cytokin Nejsilnější induktor NF-kappaB aktivace NIK – NF-kappaB indukující kináza IKK – IkappaB kináza MEKKs – MAPK/ERK kináza kinázy MAPK - Mitogenem aktivovaná protein kináza (JNK, p38, ERK) ERK - Extracelulárním signálem regulovaná kináza JNK – cJun N-terminální kináza p38 – stresem aktivovaná kináza NF-kB a apoptóza DISC - – death inducing signaling complex Podpora přirozené imunity • Produkce pro-zánětlivých působků - Interleukiny, chemokiny, TNF; IFNb, RANTES - Imunoreceptory (TNF-R, MHCI, imunoglobuliny) - Buněčná adheze (ICAM1, ELAM1, VCAM1, selektiny, tenascin C) - Proteiny akutní fáze zánětu (faktory komplementu, CRP, LPS R, angiotensinogen) - Členové rodiny NF-kappaB • Anti-apoptotická role je spojena s podporou zánětlivého procesu - Apoptotická tělíska pohlcená makrofágy jsou neimunogenní • Role Bcl-3 v T lymfocytech - Vazba na homodimery p50 a p52 v jádře mění tyto represory na aktivátory transkripce • Podpora dozrávání B lymfocytů - IKKa podporuje aktivaci dimerů p52/RelB – produkce proteinů posilujících rezistenci B lymfocytů k apoptóze x PODPORA CHRONICKÉHO ZÁNĚTU!!! (revmatoidní artritida, kardiovaskulární nemoci, autoimunitní nemoci) Podpora proliferace • Cytokiny a jejich receptory produkované působením NF-kappaB působí jako růstové faktory - Aktivuje geny pro G-, M-, GM-CSF, VEGF • Aktivuje expresi cyklinu D1 nutného pro přechod G1/S • Aktivuje expresi c-Myc – transaktivuje geny pro cykliny a potlačuje expresi p21 • v G1,G2 fázi – hl. role Akt - fosforyluje IKK + Chk1 je inaktivní • v S fázi je to naopak + role RelA a p100 Regulátor stresové odpovědi Stresory aktivující NF-kappaB: • Infekce • Ischemický/reperfúzní stres • Hemorhagický šok • Poškození jater • Ozáření organismu (UV, g) • Oxidační (ROS (?) a NOS metabolizmus) • Hyperglykemický stres • Xenobiotický (cigaretový kouř, těžké kovy, PCB, cytostatika) NO metabolizmus Vliv na karcinogenezi NF-kappaB Potlačuje rozvoj apoptózy + Indukuje proliferaci, angiogenezi + Zvyšuje metastatický potenciál + Podporuje zánětlivé procesy = Podmínky vhodné pro karcinogenezi Karcinogenetický potenciál NF-kappaB Modulace aktivity NF-kappaB Detekce aktivního NF-kappaB • WB - Degradace IkappaB - Nárůst p50 a p65 v nukleárním extraktu a úbytek v cytoplazmatickém extraktu • EMSA - Electrophoretic Mobility Shift Assay » NF-kappaB v nukleárním extraktu se váže na značené oligonukleotidy obsahující kB vazné místo » Detekce komplexu nativní PAGE • Reportérový plazmid – Transfekce buněk plazmidem nesoucím kB vazná místa v promotoru genu pro luciferázu/B-gal/CAT Shrnutí • Rodina transkripčních faktorů NF-kappaB • Klasická vs. alternativní dráha aktivace • Nejsilnější aktivátor NF-kappaB je TNF-a • Pro-zánětlivé a přežití podporující účinky • Aktivován stresem • Podílí se na rozvoji chronického zánětu a nemocí s ním spojených • Podporuje rozvoj nádorových onemocnění