Taxonomie prokaryot - vědecké studium mikroorganismů (systematika) - charakterizovat tyto mikroorganismy - zařadit je určitým způsobem do taxonomických jednotek, tzv. taxonů Taxonomie - teoretické studium klasifikace zahrnující její základní vlastnosti, principy, postupy a pravidla. Systematika - studium diverzity mikroorganismů a vzájemné příbuznosti (taxonomická klasifikace, ekologie, biochemie, genetika, patologie, molekulární biologie) Taxonomie je dynamický subjekt, který se může měnit na základě dostupných údajů; skládá se ze tří oddělených, ale současně i navzájem provázaných oblastí: - klasifikace - nomenklatury - identifikace Bakteriální identifikace a veškeré typizační postupy (biochemické, fyziologické, sérologické atd.) jsou ve skutečnosti taxonomickými klasifikacemi na úrovni druhu či poddruhu. doména (v klasifikaci prokaryot se nepoužívá označení říše ani oddělení) druh. - skládá se ze seskupení jednotek sdílejících vysokou úroveň fenotypické podobnosti a současně s patrnou odlišností od zbývajících seskupení v tom samém rodu fylogenetická definice druhu - tato jednotka je definována jako: - jasně vymezená skupina navzájem příbuzných kmenů, zahrnující typový kmen - sdílející 70% a vyšší DNA-DNA homologii (DNA reasociace) - vykazující až na výjimky shodné fenotypické znaky - a současně mající některé odlišné znaky od jiných skupin Sekvenční analýza 16S rDNA klíčová pro stanovení fylogenetického postavení (97%) částečné sekvence - pro identifikaci organismů nebo pro jejich zařazení do dobře ustanovených fylogenetických skupin genomospecies poddruh variety - přípona –var: biovar (bv., kmeny vykazující navzájem speciální biochemické nebo fyziologické vlastnosti), fagovar (schopnost být lyzován různými bakteriofágy; význam např. při epidemiologických analýzách), patovar (patogenní vlastnosti pro různé hostitele), serovar (odlišení dle rozlišujících antigenních vlastností; významné především pro lékařskou mikrobiologii), aj. rod Příkladem taxonomické hierarchie bakterií je následující přehled: Doména Bacteria Kmen Proteobacteria Třída Alphaproteobacteria Řád Legionellales Čeleď Legionellaceae Rod Legionella Druh Legionella pneumophila Poddruh Legionella pneumophila subsp. pneumophila Taxonomie prokaryot - domény Bacteria a Archaea. sekvencování vysoce konzervativních oblastí genomu prokaryot (geny kódující 16S nebo 23S rRNA, RNA polymerázu, elongační faktor Tu, RecA protein, HSP60 protein) - revoluce v bakteriální taxonomii Prokaryotní organismy - převážně jednobuněčné organismy nukleoplasma není, až na výjimky, oddělena od cytoplasmy jadernou membránou a nedělí se mitoticky - - cytoplasmatická membrána vytváří měchýřkovité, lamelovité nebo trubicovité výstupky do cytoplasmy - - cytoplasmatické organely jsou nezávislé na cytoplasmomembránovém systému - - většinou mají pevnou buněčnou stěnu, jejíž základní složkou je peptidoglykan (murein) - - ribozómy jsou rozptýleny v cytoplasmě a jejich sedimentační koeficient je 70S (endoplasmatické retikulum není přítomno) - - výživa je vyžadována v molekulární formě - - buňky mohou být nepohyblivé, nebo pohyblivé pomocí bičíků, či vykazovat klouzavý pohyb po povrchu substrátu - - jsou všudypřítomné ve většině prostředí Příklad rozdílných charakteristik prokaryot a eukaryot: Znak prokaryota eukaryota Nukleoplasma oddělena jadernou membránou - + Mitochondrie, ER přítomné - + Lokalizace ribozomů: v cytoplasmě + - připojené k ER - + Steroly přítomny v membráně - + Buněčná stěna obsahuje peptidoglykan variabilní - Respiratorní a fotosyntetická funkce pigmentů a enzymů + - Chloroplasty u fototrofů - + Buňky se dělí mitoticky - + Kruhový chromozóm + - Lineární chromozóm - + Sedimentační konstanta ribozomů: 70S + - 80S - + Sedimentační konstanty ribozomální RNA: 16S, 23S, 5S + - 18S, 28S, 5,85S, 5S - + Prokaryota a „trofie“: zisk energie a zdroj uhlíku jsou navzájem nezávislé! Podle způsobu získávání energie můžeme rozlišovat: - chemoorganotrofie - chemolitotrofie - fototrofie (oxidace = ztráta elektronů; redukce = příjem elektronů) A podle výživy je možno prokaryota charakterizovat: - autotrofní - mixotrofní - heterotrofní Takže potom už lze jednoduše odvozovat: fotoheterotrofie, fotoautotrofie, fotomixotrofie, chemoautotrofie, chemoheterotrofie, chemomixotrofie…. Prokaryotní typ buněk - doména Archaea a Bacteria Doména Archaea - organismy vyskytující se ve vodách, na souši (především v anaerobních, hyperslaných nebo hydrotermálně či geotermálně vyhřívaných prostředích); symbioticky v trávicím traktu živočichů = extremofilové. Znakem je přítomnost éterové vazby mezi glycerolem a vyššími mastnými kyselinami u lipidů v plazmatické membráně (u bakterií je esterová); postrádají murein (peptidoglykan obsahující kyselinu muramovou) v buněčné stěně Znaky odlišující zástupce domén Bacteria a Archaea: Znak Bacteria Archaea Buněčná stěna obsahuje kyselinu muramovou + - Éterová vazba mezi glycerolem a karboxykyselinami - + MK navázány na glycerol esterovou vazbou + - První aminokyselinou při proteosyntéze je: Metionin - + N-Formylmetionin + - Proteosyntéza inhibována anisomycinem - + Proteosyntéza inhibována Kan, Chlor + - Některé tRNA geny obsahují introny - + RNA polymerázy jsou: vícesložkové enzymy - + inhibovány rifampicinem + - (blízká příbuznost mezi doménami Archaea a Eucarya a ne mezi Archaea a Bacteria - určité molekulární znaky mají archaea shodné s doménou Eucarya) Doména Bacteria - tři fenotypická oddělení (gramnegativní typ buňky mající buněčnou stěnu; grampozitivní typ buňky s buněčnou stěnou; postrádají buněčnou stěnu). Toto členění - dávalo představu o diverzitě bakterií - nebralo v úvahu chemotaxonomii ani molekulární taxonomii bakterií a jejich vzájemné fylogenetické vztahy Doména Bacteria Bakterie - nejpočetnější biotická složka (všudypřítomné v půdě, vodě i jako symbionty jiných organismů; některé jsou patogenní) Gramnegativní bakterie s buněčnou stěnou - buněčná stěna složena z vnější lipopolysacharidové membrány a vnitřní relativně tenké peptidoglykanové vrstvy obsahující kyselinu muramovou. - barví se gramnegativně, ačkoliv někdy přítomnost exopolysacharidové vrstvy okolo vnější membrány může způsobit grampozitivní zbarvení - buňky jsou kulaté, oválné, nebo tvaru tyček (rovné či zakřivené), šroubovic či vláken; ojediněle s pochvou nebo opouzdřené - mohou být fototrofní nebo jsou nefototrofní, a to jak litotrofní, tak i heterotrofní Grampozitivní bakterie s buněčnou stěnou - chybí vnější membrána a peptidoglykanová vrstva je poměrně tlustá - mohou mít jako složku buněčné stěny kyselinu teichoovou a/nebo neutrální polysacharidy; několik zástupců obsahuje mykolové kyseliny - barví se grampozitivně - tvar buněk je kulatý, tyčkovitý nebo vláknitý a tyčky i vlákna se mohou větvit; někteří zástupci – endospóry - většinou heterotrofní Odlišné znaky bakterií s buněčnou stěnou a barvící se G+ nebo G-: Znak gramnegativní grampozitivní Vnější membrána stěny je přítomna + - Barví se acidorezistentně - variabilní Vláknité formy, větvící se hyfy - variabilní Teichoová kyselina přítomna - variabilní Lipopolysacharidy přítomny + - Bakterie postrádající buněčnou stěnu - obecné označení - mykoplasmata - nejsou schopny syntetizovat prekursory peptidoglykanu - buňky obklopeny cytoplasmatickou membránou, velice pleomorfní ve tvaru a velikosti - k růstu vyžadují komplexní média Klasifikace, nomenklatura a identifikace Taxonomie je obecně brána jako dílčí synonymum systematiky nebo biosystematiky a je dělena do tří celků: klasifikace, nomenklatury a identifikace Klasifikace - zařazování jednotek do skupin (taxonů) na základě jejich podobnosti a příbuznosti) - vyžaduje znalost význačných morfologických, biochemických, fyziologických, chemických, molekulárně - biologických a genetických charakteristik (znalosti získávány jak experimentálními, tak i pozorovacími technikami) - klasifikace prokaryot je veličina vytvořená pro mikrobiology a ne pro jednotky, které jsou klasifikovány - založena na komplexu dostupných údajů Numerická taxonomie - vyvíjí se jako část náročných analýz - cílem bylo navržení stabilní sestavy metodik - umožnila rozlišení jednotlivých kmenů prokaryot do homogenních skupin (shromažďování údajů, zakódování, vypočítání podobnosti, analýza) - sdružování do fenotypických skupin - v hrubých rysech totožné s taxony (forma matic) Historické hledisko - morfologická kritéria Praktická klasifikace (morfologické, biochemické a fyziologické údaje) Fylogenetická klasifikace - fenotypické vlastnosti doplněné o výsledky metod molekulární biologie a o chemotaxonomické údaje Oficiální klasifikace Studium nukleových kyselin - poprvé aplikováno před více než 40 lety - stále je jednou z hlavních technik u prokaryot (mol. % G+C, RNA/DNA hybridizace, katalogizace rRNA nukleotidů, denaturace a renaturace DNA) Genotypové informace - odvozeny od nukleových kyselin Genotypové metody - přímo zaměřeny na studium polymorfizmu DNA nebo RNA molekul - obráží přirozené příbuzenské vztahy kódované DNA - cíleny buď na celkovou DNA nebo jen na určitý úsek DNA (případně na analýzu plazmidové DNA) Studium celkové DNA: Mol %G+C RFLP analýza PFGE Velikost genomu DNA-DNA hybridizace Studium části DNA: Ribotypizace AFLP PCR metody (ERIC-PCR, rep-PCR, tRNA-PCR) DNA sondy DNA sekvencování „Fingerprinting“ plazmidové DNA: Analýza polymorfizmu plazmidové DNA RFLP analýza plazmidové DNA AFLP analýza plazmidové DNA Cistrony - části chromozomu řídící jednu funkci Klíčovou metodou systematiky prokaryot je srovnání rRNA DNA-rRNA hybridy 16S rRNA katalogizace Molekulární typizace a detekce Rozvoj molekulárně biologických technik - molekulární typizace Genetická diverzita - diferenciace odlišných klonů mezi izoláty shodného druhu (z různých zdrojů a míst i v různých časech) = subtypizace Polymorfismus – tímto označením se míní v populaci současná existence dvou nebo více mutantních alel genu umístěného v příslušném lokusu na chromozomu Typizační techniky - děleny do tří skupin: - založené na lipopolysacharidech a mastných kyselinách: SDS-PAGE lipopolysacharidů; FAME - používá se pro G- tyčky - založená na analýze složení proteinů buněčné stěny a vnější membrány: SDS-PAGE, subtypizace G- bakterií; multilokus enzymová elektroforéza - založené na nukleových kyselinách: DNA sekvencování - přímé stanovení sekvencí nukleotidů v DNA restrikční analýza chromozomální DNA - srovnání počtu a velikostí fragmentů po působení RE (univerzálně aplikovatelná, citlivá, snadná metoda) – ribotypizace restrikční analýza plazmidů .- extrakce, separace pulzní gelová elektroforéza - velké fragmenty DNA, analýza fragmentů bez nutnosti hybridizačních metod polymerázová řetězová reakce - amplifikační metoda, znásobení specifických sekvencí DNA nebo RNA, detekce (opakování cyklu denaturace, připojení primerů, prodloužení, znovu denaturace a tyto kroky se mnohonásobně opakují) Technologie sond NK - významná úloha v klinických mikrobiologických laboratořích - detekovat a charakterizovat mikroorganismus odpovědný za onemocnění - využití tam, kde způsobující agens je málo aktivní, či nebylo izolováno - aplikace adaptovány nejen pro výzkum, ale i k diagnostickým účelům. Sondy NK = segmenty DNA nebo RNA, které byly označeny (komerčně připravované DNA sondy - řadu bakteriálních patogenů) Patogen - označení mikroorganismu schopného způsobit onemocnění. Primární patogen způsobí onemocnění kdykoliv se setká s hostitelem a přežívání primárních patogenů je na hostitelích závislé. Oportunní patogen způsobí onemocnění hostitele za specifických podmínek a současně se běžně vyskytuje také i mimo hostitele. DNA sondy - značeny radioaktivním fosforem; nyní se používají jiné látky, např. enzymy, chemiluminescentní molekuly, látky afinitní povahy; po hybridizaci jsou imunologicky detekovány. Výhody použití sond: - zkracuje se čas nezbytný k identifikaci náročného mikroorganismu - laboratoř může zvýšit počet typů patogenů, které detekuje a identifikuje - umožňuje průkaz agens, které tradiční kultivační techniky neumožňovaly - rozlišení biochemicky podobných patogenních a nepatogenních kmenů „Použitelnost“ některých klasifikačních metod Sérologie a chemotaxonomie Sérologické techniky – využívají chemického složení stěny bakteriálních buněk chovat se jako antigen, tj. vyvolat produkci protilátek (aglutinace, precipitace, komplement fixační reakce nebo imunofluorescence) Chemotaxonomie – založena na stanovitelných chemických znacích (metody analytické chemie) – orientuje se primárně na analýzu chemického složení buněčné stěny nebo jen její části v pevné fázi (vlastní masa buněk) přítomnost/nepřítomnost stabilních chemických znaků poměrné zastoupení – profil v tekuté fázi (metabolity, supernatant stráveného kultivačního média) peptidoglykan – chemické složení kyseliny teichoové – význam u G+ bakterií polární lipidy - fosfolipidy, glykolipidy, fosfoglykolipidy mastné kyseliny – zhruba 100 jich má význam pro klasifikaci prokaryot (nasycené, nenasycené, větvené, hydroxykyseliny); MIDI Sherlock System mykolové kyseliny – vyskytují se v buněčné stěně, vázané na peptidoglykan chinony, steroly, karotenoidní pigmenty polyaminy – významné především u termofilních bakterií lipopolysacharidy, cytochromy, bakteriochlorofyly Polyfázová taxonomie - taxonomie založená na kombinaci údajů získaných rozmanitými technikami - obsahuje všechny dostupné genotypové, fenotypové a fylogenetické informace - použití jen jedné metody je nedostatečné a je vyžadován mnohostranný přístup – tzv. „polyphasic approach“. Nomenklatura Nomenklatura = označení jednotek definovaných pomocí klasifikace Je řízena mezinárodním nomenklatorickým kódem, nomenklatura může obsahovat dvě části: - informační či neplatné jméno (jména nemocí, antigenních variant) - vědecké pojmenování (Mycobacterium tuberculosis) Jméno - představuje binární kombinaci rodového jména a druhového označení - musí vyhovovat pravidlům z International Code of Nomenclature of Bacteria (mezinárodně akceptována, bakteriální nomenklatura se jim musí podrobovat) - stabilní, jednoznačná, nezbytná Jméno prokaryotního taxonu je založeno na: Validní publikaci – Int. J. Syst. Evol. Microbiol. Legitimitě – pravidla z International Code of Nomenclature of Bacteria Prioritě publikace – dřívější pojmenování je platné Efektivitě publikace - zveřejnění tištěných materiálů dostupných vědecké komunitě za účelem poskytnutí stálého záznamu Approved Lists of Bacterial Names International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IJSEM) - originální článek nebo Validation List „Bacillus mesentericus“ - Jméno je ze dvou částí: jméno rodové, za ním následuje označení druhové, což je většinou vyjádření specifických vlastností (poddruhové jméno) Hlavní principy pro validní označení nového taxonu (bakterie nebo archaea): - priorita popisu - nomenklaturní typy: typová kultura, neotyp - podrobný popis: úplný popis nového taxonu, diagnóza Validní publikace Publikaci nového taxonu vyžaduje: - jméno nesmí být homonymem již dřívěji uznaných jmen - taxon nesmí být synonymem dřívějších taxonů - základní popis a typová kultura („sp. nov.“; „gen. nov.“; „comb. nov.“) Uznání popisu - taxonomické subkomise („minimální standardní sestavy“) úroveň rodu: - procentuální obsah G+C bazí - barvení, struktura buněčné stěny, typ metabolismu, kataláza a pohyblivost - tvorba kyseliny z glycerolu, citlivost či rezistence k lysostafinu, lysozymu, furazolidonu, bacitracinu a pteridinu; složení menachinonů, stanovení sekvencí a katalogizace rRNA oligonukleotidů druhový popis: - hybridizace DNA-DNA a stanovení bodu denaturace, ribotypizace - morfologie kolonií, produkce pigmentu, kultivační podmínky, využívání cukrů, citlivost k novobiocinu, enzymatické testy (fosfatáza, arginin dihydroláza, ornithin dekarboxyláza, ureáza, …), koaguláza, hemolýza - produkce acetoinu, stanovení kyseliny mléčné, tvorba kyseliny z cukrů, hydrolýzy, citlivost k antibiotikům, analýza cytoplazmatické membrány, stanovení proteinu A, zjištění profilu celobuněčných proteinů Moraxella (Branhamella) catarrhalis Sporná nová jména - posudek od Judicial Commission of the International Union of Microbiological Societies Zařazení mikroorganismu do rizikové skupiny dle patogenity Odůvodnění nomenklaturních změn - nomenklatura následuje taxonomickou klasifikaci. - využití fenotypických, genetických a fylogenetických charakteristik vedlo k řadě změn v klasifikaci i v nomenklatuře. Identifikace Identifikace je: - proces porovnávání neznámého se známým - praktickou aplikací klasifikace a nomenklatury Identifikační schémata X klasifikační schémata Bakteriální identifikace je prováděna pomocí mikrotestů. Automatizované systémy - citlivost k ATB, hemokultury aj. (změna pH, uvolnění chromogenu či fluorogenu, detekce metabolitů) Imunodiagnostické metody Chromatografické metody Práce s čistou kulturou (izolovaná kolonie ¹ čistá kultura; selektivní média) Neúspěšná identifikace Numerické metody - realizace problematická, význam z vědeckého hlediska Pro klasifikaci má každá zjištěná charakteristika stejnou váhu X pro identifikaci mohou být některé znaky zvýhodněny oproti druhým