• jednoduchá, rychlá, spolehlivá chemotaxonomická technika vysoká citlivost a reprodukovatelnost Proč proteiny?? • Vysoce informativní markery současného stavu kultury • „protein turnover“ – změny za různých podmínek prostředí, stresů.. (technologie, transport kultur, vliv látek…) • Systematické mapování proteinů – taxonomie, studium fce proteinů • Databáze proteomu (SWISSPROT) Analýza MALDI-TOF MS • Jednotný spolehlivý protokol přípravy MALDI‑MS profilů u daného bakteriálního rodu - OPTIMALIZACE - podmínky kultivace - příprava vzorku - MALDI-MS analýza „intaktních“ buněk - odlišení rodů, jednotlivých druhů rodu - až individuálních kmenů daného druhu Př: klasifikace Aeromonas • Aeromonas • Aeromonas hydrophila • Aeromonas hydrophila ssp. hydrophila • Aeromonas hydrophila ssp. hydrophila CCM 7232 ^T • Aeromonas hydrophila ssp. hydrophila CCM 1271 CCM 1275 • Aeromonas caviae (A. media, A. eucrenophila, A. encheleia) Aeromonas hydrophila (A. bestiarum, A. salmonicida, A. popoffii ) Aeromonas sobria (A. veronii, A. jandaei, A. schubertii ) Problematická identifikace aeromonád Základy metodiky přípravy a analýzy vzorku: Příprava vzorku pro analýzu Příprava vzorku pro analýzu jiný příklad: extrakce v acetonitrilu • Každý kmen - 3 spoty na MALDI desce - vysušení při RT • MALDI-TOF MS analýza MALDI-MS profil • Proteiny – ribozomu, membrány možnost rozlišit úzce příbuzné druhy, neodlišitelné genotypizačními metodami a biotypizací • Podmínky kultivace mají na výsledná spektra malý vliv – určitá hladina konstantních signálů Vychází se z analýzy „bazální“ výbavy proteomu konstantní výskyt základních char. signálů (základní hladina proteinů syntetizovaná stále nezávisle na změně podmínek) • Pomalu rostoucí – prodloužení doby kultivace • Chemikálie – ! nejvyšší čistoty ! (pro MS či HPLC) • Pozor na uvolňování látek z „nekvalitních“ plastů Porovnání spekter 3 typových kmenů různých rodů Porovnání spekter kmenů druhu P.aeruginosa (šipka označuje stejné signály odlišné intenzity) • 1 spektrum - suma 100‑150 zásahů laseru • 1 spot 5 spekter • SOFTWARE SHLUKOVÉ ANALÝZY 1) FI MU - Ing. Matej Lexa, Ph.D. - spektra převedena na ASCII formát (mass range 3 000 ‑ 15 000 m/z) - transformována do páru vektorů - je vypočítána jejich cosinová vzdálenost a provedeno hierarchické agglomerativní shlukování založené na vzájemné podobnosti spekter 2) Biotyper Software (Bruker Daltonics) - komerční MALDI-MS fingerprints‘ use in species discrimination · Which bacterial species are present in different parts of technology process? Reuteri group: - at least 6 species isolated from sourdough (L. frumenti, L. pontis, L. panis, L. reuteri, L. rossiae, L. siliginis, L. secaliphilus) = species adapted to the particular niche interesting challenge for a proteomic study to link ecological specification to functional characteristics embedded in the proteome of the strains. MALDI-MS profiles of pure culturable cultures through technology proces • Species and strains identity confirmation The use of MALDI-MS fingerprints in comparing of strains with specific patterns = characterization of the strain • Strain-dependent properties: probiotics: up (host mucin production) and down regulation (virulence factor expression in pathogens), production of specific antibiotics and antibiotic-like substances (reuterin…) technology: proteolytic and lipolytic patterns: flavour, ripening, gaps forming … • By novel or uncharacterized strain: prediction of strain-specific properties Optimalizace metody Test typu a okyselení matrice (sDHB v 20% ACN s 1% TFA) Medium, hustota suspenze vzorku (2 µl buněk + 500 µl voda : ACN 1:1) Test reprodukovatelnosti Vliv délky zamražení, kultiv. teplota Využití techniky MALDI-TOF MS • Citlivá analytická ionizační technika MS (UV laser) • Proteomika: šetrná ionizace peptidů a proteinů • Využití MALDI-TOF MS v mikrobiologii: MALDI-MS profil - identifikace rodu a druhů - autentizace kmene - analýza biomarkerů Klinická diagnostika: Bacillus (i spory), Campylobacter, Clostridium, Corynebacterium, Escherichia, Haemophilus (screening nemocničních kmenů), Helicobacter, Legionella, Mycobacterium, Salmonella, Streptococcus, Staphylococcus (MRSA a MSSA) Rychlá chemotaxonomie – i druhy fenotypicky a genotypicky nerozlišitelné Enviromentální studie, potravinářství – kontrola čistoty, pg MO Analýza specifických proteinů bakterií, hub a virů: rekombinantní proteiny, faktory virulence, enzymy, metabolity, proteiny sporových stěn a S-vrstvy, významné je studium bakteriocinů, peptidové mapování Sekvenování bakteriálních nukleových kyselin • Referenční spektra: je možno identifikovat neznámý vzorek Současné cíle a využití techniky • Zavedení a optimalizace stanovení MALDI-MS profilů bakterií • Ověření diferenciační schopnosti MALDI-MS • Snaha získat : reprodukovatelná charakteristická spektra rodů a druhů à autentizace, identifikace kmenů • Interpretace a statistické zpracování výsledných spekter - vhodný software Pro shodnocení hladiny spolehlivosti odlišení: identifikace (species) + typizace (kmeny) porovnání různých typů software: MALDI-TOF MS Moderní technika pro mikrobiologii • Kapacita v odlišení a klasifikaci kmenů na druhové a poddruhové úrovni (př:MRSA, MSSA!!!) • Přímá identifikace mikroorganismů • rychlý screening či selektivní monitoring patogenů či metabolických produktů MO • Detekce a analýza unikátních proteinů a biomarkerů • Sledování dané kultury v čase!!! Výhody MALDI-MS Vysoká rychlost a jednoduchá příprava vzorku • Malý objem vzorku; šetření chemikáliemi • Vysoká citlivost a nízký detekční limit • Vysoce reprodukovatelný výstup - taxonomie, klin. diagnostika, charakterizace průmysl. kmenů • Rychle vyvíjející se metodika tvorby databází a statistického hodnocení výsledků • Možnost srovnání s informacemi sekvenování genomu, proteinů • Možnost kombinace s dalšími metodami (off-line separace – ELFO, HPLC) Výhody MALDI-MS • Vysoce reprodukovatelný výstup bez předchozí separace, filtrování či ošetření buněk • Vysoká rozlišovací schopnost • screening založený na rozšiřující se databázi referenčních spekter mikroorganismů Děkuji za pozornost