BUNĚČNÉ SPOJE A ADHEZE
Většina buněk v mnohobuněčném organismu je organizována do kooperativních spojení - tkání a ty jsou sloučeny v různých kombinacích do větších funkčních jednotek - orgánů. Buňky v tkáních jsou obvykle v kontaktu s komplexní sítí sekretovaných mimobuněčných makromolekul - mimobuněčnou matrix (ECM). Ta pomáhá držet buňky v tkáních pohromadě a vytváří prostor, kde mohou buňky migrovat a interagovat. V mnoha případech jsou buňky v tkáních udržovány na místě přímými buněčnými adhezemi.
U obratlovců jsou hlavními typy tkání nervová, svalová, krevní, lymfatická, epiteliální a spojovací.
V spojovacích tkáních je mnoho ECM a buňky jsou v ní volně rozptýleny.
Matrix je bohatá na vláknité polymery, zejména kolagen a je to matrix (spíše než buňky) která nese většinu mechanického stresu. Buňky jsou napojeny na komponenty matrix a jejich vzájemné spojení není příliš důležité.
V epiteliálních tkáních jsou buňky spojeny těsně mezi sebou do vrstev (epitelů) a EM tvoří hlavně tenkou basální laminu, na které leží epiteliální vrstva. Zde jsou to zejména buňky, které nesou většinu mechanického stresu prostřednictvím silných vnitrobuněčných proteinových vláken (složek cytoskeletonu), které křižují cytoplasmu každou epiteliální buňku. Pro přenos mechanického stresu z jedné buňky na druhou jsou vlákna přímo nebo nepřímo napojena na transmembránové proteiny v plasmatické membráně, kde se tvoří specializované spoje mezi povrchy sousedních buněk a se spodní bazální laminou. Epiteliální vrstvy vyplňují dutiny a volné povrchy v těle a specializované spoje mezi buňkami umožňují těmto vrstvám tvořit bariéry pro pohyb vody, roztoků a buněk mezi jednotlivými tělními kompartmenty.
EPITEL TENKÉHO STŘEVA
Fig. 1. The anatomy of the small intestinal epithelium. The epithelium is shaped into crypts and villi (left). The lineage scheme (right) depicts the stem cell, the transit-amplifying cells, and the two differentiated branches. The right branch constitutes the enterocyte lineage; the left is the secretory lineage. Relative positions along the crypt-villus axis correspond to the schematic graph of the crypt in the center.
Krypty a villi. Kmenové buňky, přechodně se dělící buňky, diferencující se linie (enterocytární a sekreční)
Obnova střevní výstelky
LUMEN OF GUT
lepithelial cell migration pom "birth" at the bottom lot the crypt to Joss at the hop of the villus [{transit time is |3-5 days)
lepithelial (cells
Icrypt
loose
Iconnective
tissue
villus (no cell division}
cross section of villus
cross section of crypt
villus
absorptive brush-border cells
mucus-secreting goblet cells
direction of movement
(A)
nondividing differentiated Paneth cells
nondividing differentiated-
cells
rapidly dividing cells {cycle time - 2 hours
slowly dividing stem
cells (cycle time > 24 hours
crypt
100 urn
JFigure 22-19 part 1 of 2. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. Figure 22-19 part 2 of 2. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition.
Příčný řez částí stěny střeva
smooth m u sel e
cell
Figure 19-1. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition._
Každá tkáň je organizovaným seskupením buněk držených pohromadě buněčnými adhezemi, ECM nebo oběma.Tkáně jsou spojeny dohromady v různých kombinacích a tvoří funkční jednotky - orgány
Mezi buňkami navzájem a buňkami a ECM se tvoří
speciální spoje (junctions) zprostředkované specifickými adhezními
molekulami na buněčném povrchu.
ADHEZNÍ INTERAKCE - interakce zprostředkované membránovými molekulami. Na základě strukturních vlastností rozlišujeme rodinu:
► kadherinů (asi 80 typů)
► imunoglobulinů (přes 700 typů)
► integrinů
► selektinů
Slouží nejen ke spojení buněk navzájem a k jejich zakotvení v daném kompartmentu, ale jsou spojeny s aktivací buněk, s přenosem signálu do nitra buněk a s komplexní buněčnou odpovědí (regulace buněčného cyklu, indukce diferenciace, apoptózy, atd.).
Adhezní interakce jsou klíčové pro zajištění aktivity imunitního systému.
Mechanizmy, jimiž mohou povrchové molekuly zprostředkovat buněčné adheze
HOMOPHILIC BINDING       HETEROPHILS BINDING       AN EXTRACELLULAR
LINKER MOLECULE
igure 19-26. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition._
Typy vazeb
1) homofilní (homotypická) vazba - váží se stejné molekuly sousedních b.
2) heterofilní (heterotypická) vazba - váží se různé molekuly
3) receptory na povrchu buněk jsou spojeny navzájem sekretovanou spojovací molekulou.
BUNĚČNÉ SPOJE, ADHEZE a MIMOBUNĚČNÁ MATRIX (ECM)
Buněčné spoje (junctions) - tři funkční skupiny:
► „tight junctions" (TJ) - těsné spoje (epitel střeva) selektivně propustná bariéra - udržují lokální koncentraci tekutin
► "anchoring junctions" - ukotvující spoje - mechanicky spojují buňky a jejich
cytoslekelet se sousedními buňkami nebo ECM - časté u tkání vystavených mechanickému stresu (pokožka)
místa připojení filament aktinu:
spoje buňka-buňka (např. adhezívní pásy u epitelů)
spoje buňka-matrix (fokální kontakty nebo adhezivní plaky )
místa připojení intermediárních filament: spoje buňka-buňka (desmosomy) spoje buňka-matrix (hemidesmosomy)
► "communicating junctions"- komunikační spoje - zprostředkovávají přenos chem.
nebo el. signálů mezi interagujícími buňkami. "gap junctions" - mezerovitá spojení chemické synapse
Těsná spojení slouží v epitelech jako bariéra difúze
rozpuštěných látek
Figure 19-3. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition.
TJ jsou vysoce dynamické struktury regulující přechod iontů a molekul v epiteliálních a endoteliálních buňkách. Tvořeny specifickými proteiny - okludiny, klaudiny
Úloha těsných spojení v buněčném transportu
Aktivace signálních drah regulujících tvorbu a funkci těsných spojení
Aktivátory MAP kináz, které vedou ke ^^^^^^^^^H
nebo k upevnění TJ (modře) a zvýšené bariérové funkce
Ukotvující (anchoring) vazby (spoje)
vazba
transmembranovy extracelularni adhezní protein ligand
intracelulární cytoskeletÁrní upevnění
intracelulární kotevní proteiny
Buňka-Buňka Adherentní vazba
Desmozóm
kadherin (E-kadherin)
kadherin (desmoglein, desmocollin)
kadherin v sousední buňce
desmogleiny a desmocolliny v sousední buňce
^aktinová vlákna^
intermediální vlákna
a-a p-kateniny, vinculin, a-aktinin, plakoglobin (y-katenin)
desmoplakiny, plakoglobin (y-katenin)
Buňka-Matrix Fokální adheze
Hemidesmozóm
integrin 1rtegrmV6p4, BP180
proteiny
extracelulární matrix proteiny
extracelulární matrix
aktinová vlákna
intermediální vlákna
talin, vinculin,
a-aktinin, filamin plektin, BP230
Cell Adhesion Molecules (CAM)
Buňky uvolněné z různých tkání embrya obratlovců (jsou-li smíchány dohromady) znovu přednostně spojují s buňkami téže tkáně.
Tento tkáňově specifický rozeznávací proces u obratlovců je zprostředkován zejména
rodinou na vápníkových iontech závislých adhezivních proteinů - kadherinů, které drží buňky pohromadě homofilními interakcemi mezi transmembránovými kadheriny přiléhajících buněk. Aby buňky držely pohromadě, musí být kadheriny připojeny k cytoskeletonu.
Většina živočišných buněk má také
na vápníku nezávislý adhezívní systém buňka-buňka, který zahrnuje zejména členy imunoglobulinové nadrodiny, jako jsou neurální adhezívní molekuly (N-CAM, ICAM apod.)
Jednotlivé buněčné typy používají mnohonásobné molekulární mechanismy pro adhezi k jiným buněčným typům nebo EM, avšak specifita vzájemné buněčné adheze pozorovaná v embryonálním vývoji musí vyústit v integraci řady různých adhezívních systémů, z nichž některé jsou spojeny se specializovanými buněčnými spojeními a jiné ne.
Adherentní spoje buňka-buňka
► závislé na Ca2+
U epitelů často tvoří souvislý adhezivní pás (zonula adherens) kolem každé interagující buňky,
lokalizovaný hned pod těsnými spojením.
Homotypické mezibuněčné interakce jsou zprostředkovány
transmembránovými vazebnými glykoproteiny - kadheriny (E-k. - epitelia, N-k. - nervové buňky, P-k. - placenta a epidermis). Na cytoplazm. straně membrány se tvoří komplexy CAC (Cadherine Associated Complex) spojující přes vazebné proteiny (^^H katenin, vinkulin, Q aktinin) kadherinové molekuly se svazky vláken aktinu.
Desmosomy fungují jako nýty epitelia a spojovacích tkání. Uvnitř buněk fungují jako ukotvení pro intermediární filamenta - keratinová filamenta (epitely), desminová filamenta (srdeční sval)
Selektiny (P-,     L-) - menší rodina transmembránových glykoproteinů vážících se na cukerné zbytky na bílkovinách - přechodné vazby buněk v krevním řečišti - umožňují např. bílým krvinkám vazbu k endoteliálním b. a tak migrovat z krve do tkání v místech zánětu.
► nezávislé na Ca2+
zprostředkované členy imunoglobulinové superrodiny - zejména na leukocytech, ale i na
endotelových, epiteliálních a dalších buňkách. ICAM (InterCellular Cell Adhesion Molecules)
Heterotypické mezibuněčné vazby - aktivované u endoteliálních buněk, kde se váží s integriny bílých krvinek
Schéma ukotvujícího spoje ze dvou tříd proteinů
cytoskeletal plasma membranes filaments
intracellular transmembrane anchor proteins    adhesion proteins
Figure 19-8. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition
Napojení klasických kadherinů k aktinovým filamentům
Interakce kadherin-katenin
Wnt signální dráha
Dimerizace molekul E-cadherinu je závislá na Ca2+
000000
Poruchy adheze zprostředkované E-kadherinem mohou vést k uvolnění buněk z tkáně
Význam pro vznik nádorových metastáz
Struktura a funkce selektinů
význam pro funkci buněk imunitního systému
Adherentní spoje buňka - mimobuněčná matrix (ECM)
Specializované oblasti membrány - fokální kontakty nebo adhezívní plaky, kde končí svazky aktinových vláken.
► Integriny - transmembránové vazebné proteiny - členové velké rodiny povrchových buněčných receptorů pro matrix zprostředkovávají adhezi a slouží jako spoj mezi matrix a svazky aktinu v placích. Tvoří heterodimery (řetězce alfa a beta)
► Hemidesmosomy - podobné morfologicky desmosomům, ale funkčně a chemicky odlišné - spojují bazální povrch epiteliálních buněk s bazální laminou.
INTEGRINY
Základní receptory pro vazbu k ECM se slabou afinitou k ligandu
Alfa a beta podjednotky jsou spojeny nekovalentními vazbami
Fungují také jako přenašeče signálů - po aktivaci vazbou na matrix aktivují
různé vnitrobuněčné signální dráhy, mohou kooperovat s jinými receptory a
regulovat buněčnou proliferaci, přežívání i diferenciaci.
S cytoskeletem, kinázami a s receptory pro růstové faktory jsou integriny
propojeny adaptérovými proteiny.
Nahloučené integriny tvoří tzv. imunologické rafty.
Vznikají multimolekulové agregáty - místa fokální adheze
Bez zakotvení přes integriny buňky nemohou přežívat. Integriny aktivují tyrosin
kinázy, např. fokální adhezívní kináza (FAK -Focal Adhesion Kinase) integrin-
linked kináza (ILK) a kinázy rodiny Src. FAK je spojena s proteiny talinem a
paxilinem. Fosforylací dochází k aktivaci systému.
Po ztrátě kontaktu s ECM dochází k tzv. anoikis (detachment induced
apoptosis)
- apoptóze indukované uvolněním buněk s fyziologických vazeb.
Indukce buněčné smrti-anoikis a změny adhezívních vlastností epiteliálních buněk kolonu
• ANOIKIS představuje typ buněčné smrti, kterou umírají epiteliální buňky pokud dojde k narušení jejich kontaktu s extracelulární matrix.
•Vznik rezistence buněk k anoikis představuje jeden z kritických momentů v karcinogenezi tlustého střeva -podpora invazivity
Pro indukci anoikis v podmínkách in vitro je používán model neadherentní kultivace buněk
E-cadherin Tcatanin
Loss of cell anchorage
/ A   FAK T,
[ bad j
caspase-2 ]
caspase-9
caspase-8
4J, cytochrome -c
caspase-
caspase-3
caspase-6
DFF
Gaspase-io]
DNA-fragmentation — cell death
j caepas6-1
ANOIKIS
Struktura subjednotek integrinového receptoru (buněčný povrch-matrix)
matrix binding
i-1
talin, filamin, and oc-actinin binding
i_i
10 nm
Figure 19-64. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition
Fokální adheze
(A) I-
10 |im
extracellular matrix protein
[Figure 19-12. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition
Regulace mimobuněčné vazebné aktivity integrinu
zevnitř buňky
Desmosomy a hemidesmosomy
Regulace komplexu E-kadherin/katenin a mechanismy degradace beta-kateninu u epiteliálních buněk
Ca2+ stabilizuje dimery E-kadherinu, ten se váže cytopl. doménou na další proteiny. Beta-katenin je normálně degradován nebo se může akumulovat při dysregulaci tohoto procesu nebo defektivním E-kadherinu. Pak je translokován do jádra, kde se váže na LEF/TCF transkripční faktor aktivující transkripci řady genů.
Katenin se rovněž může vázat na APC protein, který spolu s dalšími proteiny v makromolekulárním komplexu zajišťuje na proteasomu závislou degradaci.
cytoplasm
nucleus
f-\pTyrosine Kinases: -^[c-metR. EGF-R. c-erbB2. Src
nuclear pore complex
plasma membrane
Ubi qu iti n -depe ndent proteolysis
E3/SCF-ubiquitin ligase
Aktivace transkripce onkogenů beta-kateninem prostřednictvím LEF/TCF
FIG. 2. Schematic overview of the nuclear protein complexes containing /3-catenin or pl20cThe /3-catenin protein lacks a nuclear localization signal, but may be translocated into the nucleus through binding of its Armadillo repeats with the nuclear pore complex [103]. The transcription of particular target genes is activated when nuclear /3-catenin interacts with the amino-terminal domain of LEF/TCF transcription factors. The high mobility group (HMG) domain of LEF/Tcf proteins binds specific responsive sequences, resulting in changed DNA-bending [52]. Pontin52 may act as a molecular bridge between /3-catenin, by itself in complex with LEF/TCF, and the TATA box binding protein TBP [104]. Several target genes were already described: siamois, Xnr3and Twin in Xenopus, Ubxin Drosophiia, and c-myc, cyclin-D\, matriiysin, c-jun andc-fta-1 in mammalians. Transcription of these target genes is blocked upon interaction of the transcriptional repressors TLE/Groncho and CREB-binding protein (CBP) with the LEF/TCF transcription factors [105-107]. In Drosophiia, dCBP was reported to downregulate the Armadillo-dTCF complex by acetylation of a conserved lysine residue in the amino-terminal /3-catenin-binding region of dTCF [105]. The interaction of pi 20ctn with the Zinc finger transcription factor Kaiso was recently described [16]. Transcriptional regulation of particular target genes by the latter protein complex is unreported to date.
FIG. 1. Schematic overview of the regulation of the E-cadherin/catenin complex and the mechanism of degradation of /3-catenin protein in epithelial cells. In the intercellular space, Ca2+-stabilized E-cadherin dimers (light green) interact via their first extracellular domain with the E-cadherin dimers of a neighboring cell (dark green). Beta-catenin [Armadillo in Drosophiia), plakoglobin and p 120ctn are cytoplasmic proteins with armadillo repeats, which bind to the car boxy-terminal cytoplasmic domain of E-cadherin. The amino-terminal domain of /3-catenin interacts with a-catenin, linking the E-cadherin/catenin complex to the act in cytoskeleton, either directly through interaction of aE-catenin with F-actin microfilaments, or indirectly through binding of aE-catenin with a-actinin. Free cytoplasmic /3-catenin is normally degraded but can accumulate provided that this degradation process is disregulated and that the cytoplasmic E-cadherin tails are saturated or defective. In the latter case, /3-catenin may translocate to the nucleus where it forms a transcriptional complex with the LEF/TCF transcription factors (see Fig. 2). Cytoplasmic but not E-cadherin-associated /3-catenin can also bind to the adenomatous polyposis coli (APC) protein, both to 20-aa and 15-aa repeats. APC can homodimerize via its amino-terminal domain whereas its carboxy-terminal domain can bind to microtubules, probably via the EB1 protein [ 101]. In addition, APC contaijis SAMP repeats to which the sophisticated adaptor protein conductin binds [66]. Axin is a homologue of conductin. This macromolecular complex contains also the serine/threonine kinase GSK-3/3 and the protein phosphatase PP2A. GSK-3/3 phosphorylates both /3-catenin and APC, triggering in this way /3-catenin interaction with the F-box protein FWD-1 or /3-TRCP [102]. The latter is a component of an E3/SCF ubiquitin ligase complex, which comprises also Cul-1 and Skp-1 subunits. This interaction eventually results in proteasome-dependent degradation of the /3-catenin protein. Various other proteins with either enhancing or down regulating effects on the E-cadherin/catenin complex are also depicted and further discussed in the text. C, carboxy-terminal domain; N, amino-terminal domain; P, phosphorylation on serine, threonine or tyrosine residues. Modified after [57].
GAP JUNCTIONS -MEZEROVITÁ SPOJENÍ
gap junctional intercellular communication (GJIC)
mezibuněčné spoje z transmembránových proteinů - konexinů (asi 30
typů)
Krátký poločas života (několik hodin), rychlá biosyntéza a degradace, reakce na změny fyziologických podmínek 6 molekul konexinů tvoří konexon.
Konexony sousedních buněk se spojují v kanálek překlenující mezeru (gap)
2-4nm propustnou jen pro malé molekuly. Permeabilita je regulována. Otevírání a zavírání závislé např. na pH, konc. divalentních iontů. Aby se tvořily GJ musí buňky adherovat k podkladu a být spojeny kadheriny.
Model gap junctions
Cx43 Cx45
Hormotyptc Heterotypic Hotorönnoric: Honnonneric Hcmomeric Heterotypic
Figure 2  Assembly of connexins into gap junctions
Cx43 and Cx45, as examples of connexin family members, typical ly thread through the membrane fourtimes, with the AT, CT and CL exposed to the cytoplasm. Connexin arrangement inthe membrane also yields two extracellular loops designated EL-1 and EL-2. Six connexins oligomerize into aconnexon or hernichannel that docks in homotypic, heterotypic and combined heterotypicAieterorneric arrangements. In total, as many as 14 different connexon arrangements can form when two members of the connexin family intermix.
Figure 4   Cx43-hindiny proteins
Protein kinases known to phosphory late C>43 are shown along the top of a diagrarnnnatically represented gap-junction plaque. A number of scaffolding proteins and protei ns of unknown function that have been shown to bind directly or indirectly to Cx43 are shown along the bottom of the gap-junction plaque. It is important to note that it is not necessarily expected that all proteins shown here bind to Cx43 while it is a resident of the gap-junction plaque. MAP kinase, mitogen-activated protein kinase; CIP85, Cx43-interacting protein of 85 kDa.
Gap junctions
VIE- 2. Schematic diagram Thawing the synthetic pathway of connexins and the assembly route into homocellulnr C°e~ tween epithelial ceLls or between myoepithelial cells") or possible heterocelluJar ("between epithelial and myoepithelial cells) gap junctional (GT\ structures, and their known binding partners. Co n nexi as traffic from t he ER. to the -Golgi. Connci-ons pinch off in. vesicles from the Golgi apparatus and are transported to the plasma membrane where they align and dock with other connexons from the neighboring cell to form a gap junctional channel. The precise localization and manner of how connexin binding partners (i.e. Src_ ^-catenin, p-120 catenin, claudin. occludin. and tubulin") associate with the C-terminus- of coaneiin is not clear yet. Optimal mammary epithelial cell differentiation La a complex tissue environment requires the proper assembly of gap junctional plaques with their associated proteins in addition to proper cell/ECM interactions, cell/cell adhesion, and soluble factor signaliru^. BM basement me mbrane.
FYZIOLOGICKÁ ÚLOHA GJIC
HOMEOSTAZA rychlá rovnováha živin, iontů a tekutin
► ELEKTRICKÁ SPOJENÍ
slouží jako el. synapse u neuronů, buněk hladkého svalstva, srdečních myocytů
► TKÁŇOVÁ ODPOVĚĎ NA HORMONY
second messengers (Ca2+, cAMP, ceramid, IP3) procházejí ze stimulovaných buněk dále - šíření signálů v bun. populacích
► REGULACE EMBRYONÁLNÍHO VÝVOJE cesta pro chemické a elektrické vývojové signály
Homologní a heterologní komunikace - mezi stejnými nebo různými buněčnými typy
Změny v GJIC spojeny s kontrolou růstu, vývoje, diferenciace, apoptózy a adaptivní odpovědi
Model růstové kontroly prostřednictvím gap junctions (GJ)
Růstově stimulační signál
Růstově stimulační signál difunduje do sousedních buněk přes GJ a dosahuje substimulační úrovně
K difúzi signálu nedochází u buněk postrádajících GJ a je zahájeno buněčné dělení
Model růstové kontroly prostřednictvím gap junctions (GJ)
Růstově inhibiční signál
Růstově stimulační signál difunduje do sousedních buněk přes GJ a zabraňuje buněčnému dělení
Signál se nešíří do buněk postrádajících GJ a dochází k buněčném dělení
Gap Adherens Tight
Junction       Junction Junction
Figure 5  Junctional complexes arranged in a nexus
Gap junctions composed of connexins, adherens junctions consisting of cadherins and tight junctions made up of occludins and claudins are often closely arranged in epithelial cells and share common binding proteins flial scattoldto actin and rnicrofilaments. Binding-prutein-mediatsd cross-talk allowsthese three junctional comp lexes to act as a nexus an d be governed by so me common regulatory events.
EXTRACELULÁRNÍ (mimobuněčná) MATRIX (ECM)
ECM může ovlivňovat tvar, přežití a proliferaci buněk. Reciproční interakce mezi ECM a cytoskeletonem. Většina buněk musí být připojena k ECM, aby mohly růst, proliferovat a přežívat - závislost na substrátu (anchorage dependence) -zprostředkována integriny a jimi vybuzenými vnitrobuněčnými signály.
Makromolekuly tvořící ECM jsou produkovány lokálně buňkami v matrix, které také pomáhají její organizaci.
Ve většině spojovacích tkání jsou makromolekuly matrix sekretovány fibroblasty (chondroblasty ve chmpavce, osteoblasty v kostech apod.)
Dvě hlavní třídy molekul tvořících matrix:
1) Glykosamylglykany (GAG) - polysacharidové řetězce z opakujících se
disacharidových jednotek většinou kovalentně vázány s proteiny - proteoglykany
4 hlavní skupiny - podle typu cukru, vazby mezi cukry a počtu a lokalizace sulfátových skupin:
Hyaluronan, chondroitin sulfát a dermatan sulfát, heparan sulfát a keratan sulfát
2) Vláknité proteiny - kolagen, elastin, fibronektin, laminin -strukturální a adhezivní
funkce
Degradace komponent ECM - matrix metaloproteázy a serin proteázy Inhibitory metaloproteáz
Tři způsoby organizace bazální laminy
Souhrn spojovacích a nespojovacích adhezívních mechanizmů vazby savčích
buněk navzájem a s ECM
Souhrn různých buněčných spojení nalezených u epiteliálních buněk obratlovců