o
Oddělení funkční genomiky a proteomiky
Přírodovědecká fakulta Masarykovy university
SYNTETICKÉ OLIGONUKLEOTIDY
Hana Konečná
CENTRÁLNÍ LABORATOŘ
Masarykovy Univerzity v Brně
,o°o
V               F
oddelení funkční genomiky a proteomiky
Laboratoř molekulární fyziologie rostlin
Centrální laboratoř CL
Laboratoř analýzy biologicky významných komplexů
CENTRÁLNÍ LABORATOŘ
•   přístup k pokročilým technologiím na bázi sdílené instrumentace a její kvalifikované obsluhy
proteomické techniky genomické techniky
•   výuka - přednášky a praktické kurzy
•   členství v ABRF
(Association of Biomolecular Resource Facilities)
TECHNIKY V CENTRÁLNI LABORATOŘI
sekvenování a fragmentační analýza DNA syntéza a purifikace oligonukleotidu
kapalinová chromatografie gelová elektroforéza analýza obrazu digesce proteinů hmotnostní spektrometrie
minisklad reagencií pro molekulární biologii
SYNTETICKÉ OLIGONUKLEOTIDY
definice
aplikace
modifikace
syntéza
purifikace
kontrola kvality
design sekvence zásady navrhování software OLIGO 7 praktická ukázka
•  krátká j ednořetězcová struktura
•  DNA nebo RNA (event. PNA)
•  hydroxyl na obou koncích (normálně na 5'- konci fosfát)
oligonukleotid
i
syntetický oligonukleotid
i
primer
orientace!     polymeráza!
óh
HI
H
konstrukce duplexů
primery pro syntézu komplementární DNA PCR, Real-Time PCR hybridizační sondy pro klonování místně cílená mutageneza strukturální rentgenová analýza NA NMR studia interakcí DNA-protein potenciální léčiva gene arrays
Modifikace
0 = P-o"
B
V
o
-conjugate
2-deoxyinosin ?
univerzální báze: 3-nitropyrrol ? 5-nitroindol ?
www.glenres.com
M	A or C
R	A or G
W	A or T
S	C or G
Y	C or T
K	G or T
V	A or C or G
H	A or C or T
D	A or G or T
B	C or G or T
N	G or A or T or C
X	G or A or T or C
Příklady:
ACG TAC GTA CGT ACG TAC        nedegenerovaný
ACG TAM GTA CGT ACG TAC        M = A/C
ACG TAC GTA CDT ACG TAC         D = A/G/T
ACG TAC GTA CGT ACG NAC         N = A/C/G/T
Modifikace na 5'- konci
postsyntetické modifikace
sekvenování fragmentační analýza gene arrays Real-Time PCR
I5'
I fosforylace
►   aminoskupina
I thioskupina
| digoxigenin
biotin
enzymy
psoralen
akridin
cholesterol
fluoresc. barviva
zhášedla
2,4-dinitrofenyl
TBR-chelát ■ spacer I větvení
blokáda
Modifikace na 3'- konci
derivatizovaná matrice
3'
fosfát thioskupina
—   aminoskupina
I spacer akridin
—   biotin
—   fluoresc.barviva zhášedla cholesterol 2?4-dinitrofenyl
Real-Time PCR
2x značená sonda
REPORTER QUENCHER
	roHWARDPniMcn	.*	PROBĽ	s»»-
*t				
fi1				
				
				HEVĽnSĽ PRIMER
2, Strand d i s pi a cement: When the probe is intact, the reporter dye emission is quenched.
r i a1
S__9,
i
3, Cleavage: During each extension cycle, the DNA polymerase cleaves the reporter dye from the probe.
-cŕ-
s-1
r
■■■
—^
irr
i
4. Polymerization completed: Once separated from the quencher, the reporter dye emits its characteristic fluorescence.
si/

-*:. -■ -»-
r
fosforothioaty fosforodithioáty H-fosfonáty metylfosfonáty
r i       v
pater
cukr
modifíkace y 2'pozici modifíkace ribózové jednotky
nedegradována nukleázami!
—* modifikace fosfodiesterové vazby
0 =
o
]
P-S" I
o.
I
0 = P-CH,
i
O
0 =
o
I P-NH-alkyl
phosphorothioate
methylphosphonate       phosphoramidate
S
I
CK I   á O.
CH,
I   ä
H-C-N 3       I 0
^0
I
0=P-BK i O.
3'-thioformacetal       methylene(methyliminio)      boranophosphate
ANTISENSE oligonukleotid
oligonukleotid nebo analog komplementární k segmentu RNA nebo DNA vazbou inhibuje jejich normální funkci
Antigene (triplex)        RJbozym«
Sense/Aptamer
Peptidonukleová PNA
•  nenabitá molekula
•  vazba k DNA/RNA
N-(2-aminoethyl)-glycin
PNA
-terminal HN

Repeat J        \       f
Unit      1         N^£
IJ ° "Yi
C-terminal     PNA
DNA
5'-epct-O ^
*í*l
0=P-0"
o
■ '■   '.    ■ •
I
O B
J
o o=p'-o-
o
\3
0= P- O"
DNA 3'.end
nenabitá molekula vazba k DNA/RNA
N-(2-aminoethyl)-glycin
PNA
•  vysoká termostabilita
•  Tm nezávisí na obsahu solí
•  vyšší specifícita
•   vyšší afinita
•  rezistentní k enzymům...
o I
P-NOPr)2 O-CNEt
NHBz

DMTO—i
.O.
O     ° I P—H(Pr)z
-CNEt
6-
HN
Me2N            I         [|     y
N
DMTO-
C\
O     ° I P-N(Pr)2
-CNEt
6-
o
HN    iTCH3
cAn-J
DMTO-
O     O
P— N{Pr)2 C—CNEt
Bz-A-LNA     5-Me-Bz-C-LNA       dmf-G-LNA
T-LNA
Locked Nucleic Acid
2'-0, 4'-C methylenový můstek
potlačená flexibilita ribofuranózového kruhu
struktura je zamčena do rigidní C3-endo konformace
zlepšená hybridizace výjimečná biostabilita
Syntéza oligonukleotidu
■
organická syntéza na pevné fázi od 3'-konce k 5'-konci bezvodé prostředí
B.'
HO-
O —
O
il
CHj- C — O
Step 3. Capping
-O-
Cleavage/Dep-ratec1ion
DMT- O
^J
-O— p -o
«  "M
Step 4. Oxidation
-  O
V
DMT- O
W
- 0— p _0 _ Step 2. Coupling
U  o -
design syntéza
purifikace
EXPEDITE 8909
EXPEDITE 8909
• rychlost
• nízká spotřeba reagencií
• několik koncentračních rozsahů
• dvě paralelní syntézy
• protokoly pro FNA, RNA, PNA, fosforothioáty
• Workstation: možnost editace základních protokolů -syntéza modifikací (značení biotinem, fluroscenčními značkami, degenerované oKgonukleotidy, užití inosinu, arninoderiváty aj.)
HPLC
Perfúzní chromatografie
anex RP
IH.U1 - m.ívl
L
f
~Í0                          IS                         10                        2S                        30                         >s
Perfuzní chromatografie
POROS
klasický sorbent
POROS
1341ong.bio - 20.Opi
2
6 0 n
m
0.15-
0,10-
0.05-
0.00
100
5       10      15     20     25     30     35 /"ÍÔ? Min                         ^—^y
Min 134.bio - 20.Opi
2 6
0 a
0.15-
0.10-
rlOO

-50
0.05
Maldi-TofMS
LOOi	
	ní
	
	»•
	*»■
	■É-
	»"
er	»■
'wr'	IS-
•a	r»-
J	"■-
J!	»■
1	>
»i	
	»1
	:
	»•
	
	n
	»•"
	i*
	M'
	*•
	oj
23 m«
71CÖ
4iM                       lli»                        >*>*                       Wt
UM
Mflu/cbvgt
CE
CapiUary efcc&ophorais trace
iS
>r
«r
crude    purified cwfe purified   cnsde.    pirifjcd
Sephadex RP cartridge HPLC
in,«» - to.on
ü.üi-
LS=t
t!           «    ^.    *          IS
Gel beads have pores in them of a defined size range 'which allo'ws smaller molecules to enter hut excludes molecules larger than the pore diameters.
ooop
OQOO OOOO
oo oooo
%o oooo
— Molecules larger than gel head pores
soli oligonukleotid
Hlop.bio     —     SO. Opi
XWi
***
OBJEDNÁVKY
www.sci.muni.cz/FGP
on-line
e-mail
písemně
Soubor     Úpravy     Zobrazit     Přejit     Záložky     Nástroje     Nápověda					ú
					
<^|  - r_^  t jgP                               file:///c;/Documents%20and%205ettinas/lrnrr/DokumentyrDOCUMENTS/zaloria/CL/FGP.htm					v| O PPsjit |Q
					
i£j Mozilla Firefox LJ Přehled zpráv |G|  Startovní stránka M,..   [G]  Startovní stránka M...    [j  Bio-Chem Valve Inc. ...   jj  labelling  jj  rniniprotear	leahng-,	. n u».	z-Vyhledat G..	U  Vivascie	ice : Protein,.,   |_| ústav imunologie Pet...
DNA SEKVENDVÁNÍ A FRAGMENTAČNÍ  ANALÝZA
Genetický analyzátor DNA ABI PRISM) 310, Perkin Elmer
Automatické stanovení sekvence nukleotidu DNA metodou kapilární elektroforézy s laserovým detektorem. Z jednoho stanovení je obvykle čitelných 450 - 600 baží, Výkonnost prístroje: až 4 500 bazí/den, Další aplikací je stanovení délek fragmentů DNA, které je základem rady molekulárne-genetickýcn analýz při charakterizaci gencmových Ickusu nove izolovaných genů, charakterizaci  mutací a   určování  příbuzenských  vztahu  mezi  jedinci,   Kapacita   až  825  genotypu
' i ■:■:'■: ■    ■   [-■-: /ir.'. pr ivi-JIú slurt-v sďv-: novám
Kontaktní osoba
Objednávkový formulář pro sekvenaci DNA,
Hoto™
DESIGN OLIGONUKLEOTIDU
•   manuální
•   počítačový
www.protocol-online.org/prot/Research_Tools/Online_Tools/01igo_Design/index.html
Hlavní kritéria pro sekvenci PCR primeru
•  vysoce specifické
•  netvoří dimery a vlásenky
•  stabilní duplexy s aktivní sekvencí
•  nepříliš stabilní 3'-konec
J
OLIGO 6
OLIGO 7 (od roku 2008)
Jigo
•   PCR primery,
•   hybridizační sondy
•   sekvenační primery
•   TaqMan sondy
•   primery pro nested PCR
•   molecular beacons
•   siRNA
Terminologie PCR primerů
forward primer... část sekvence   + vlákna reverse primer... část sekvence   - vlákna
pos: |     350        tm: |    57,1
,2M               .270               ,280               ,290               .300               ,310               ,320               .330               .340                350               ,3G0               ,370 .......'.........'.........'.........'.........'.........i.........i.........'.........'.........____.........'.........'.......
«TGGC~G~GAC~ACTCA

TTAATG C C~G G C~G~G AC~AC~CACTrTTTAAG<; ATG GTATT G AG C CTATGTG G G AAG ATG AG AAAAAC AAAC G G G GAG GaC G A~G G C_AATTACATTGAACAAACAGCAGAGAC GAAGT GAC C~C AATTAC G GAC C GACACTGATGAGTGAAAAATTCCTAC CATAACTC G GATACAC C CTTCTACTCTTTTTGTTTG C C C CTC CTG CTAC C GATTAATGTAACTTGTTTGTCGTCTCTG CTTCACTGGAG
.........ACTCGGATACACCCTTCTACTC
..............................CCTCCTGaACCGATTAA
LMPGCDYSLFKDGIEPMHEDEKNKRGGRW             ITLNKQQRR5DL
UPPER- FORWARD - LEFT
5'----------------------------------►
+   5'------------------------------
3'-
'3' 5'
LOWER- REVERSE- RIGHT
Terminologie
forward primer... část sekvence   + vlákna reverse primer... část sekvence   - vlákna
pos: f 350   tm: | 57,1
,260      ,270      ,280      .290      ,300      .310      ,32Ü      .330      .340 .......'.........'.........'.........'.........'.........'.........'.........'.........'.........
350      .360      ,370 .........'.........'........
«TGGtTGTGAtTACTCA
TTAATGCCTGCCTÍTC ACTACTC AtTTTTTAAG G ATG GTATTG AG C CTA_G_G G GAAG A~GAGxAAAAC AAAC G G G GAG G AC GA_G G C_Ah—AC A~
rTTJI
AATTACGGACCGACACTGATGAGTGAAAAATTCCTACCATAACTCGGATACACCCTTaACT(.l 111 IM I IGCCCCTCCTGCTACCGATTAATGTAJJiCTTGTTTGTCGTCTCTGCTTCACTGGAG
.........ACTCGGATACACCCTTCTACTC
H-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i CCTCCTGCTACCGAl lAA
LMPGC0Y5LFKDGIEPHWEDEKNKRGGRW            ITL
NKQQRR5DL
UPPER- FORWARD - LEFT
5'                              » polymeráza-
+   51
3'-
3'
5'
polymeráza
5'
LOWER- REVERSE- RIGHT
Nasedání PCR primerů
pos: f   350        tm: |    57,1
,260               ,270               ,280               .290               ,300               .310               .320               .330               .340                 350               ,3SD               ,370 .......'.........'.........'.........'.........'.........'.........'.........'.........'.........__.........'.........'........
«TGGCTGTGACTAtTtA
i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-
hi-i-i-i-i-i-i-i-i-i-
~~AA_G C C~G G C"G"G AC"AC_C AC----------AA.G G A~G G"A—G AG C C"A"G"G G GAAG A_GAG AAAAAC AAAC G G G GAG G AC GA~G G C~AA—AC A—GAAC Aŕ
AATTAC G GAC C GACAaGATGAGTGAAAAAmaACCATMaCGGATACACCCTTCTACTU 1111GTTTC C C C CTC CTC CTAC C GATTAATGTAACTTGTTTGTCGTCTCTG CTTCACTGGAG
......ACTCGGATACACCCTTCTACTC
........................CCTCCTGCTACCGATTAA
4                      4                      H
LHPGCDY5LFKDGIEPHWE0EKHKRGGRW            ITLNKQQRR5HL
UPPER - FORWARD - LEFT
5'
+   5'--   3'-
3'
5'
5'
LOWER- REVERSE- RIGHT
5'CTTCTGCTCAATCTTTCTAC   3'   FORWARD
5' 1 ATGGbTTCTG CTCAATCTTT CTAC*\ACCAA AGCTCTGTCT TGAAAATCAA 51 TGTCA7GG77 GTGGmCGmTG mTCATGTTTT CCTTGATATC ATGTCACGCA 101 TGCTTCAACA CTCCAAATAC AGAGGTAATT AAATATTATT ATCATATTAT 151 ATATAATATG TTATTGATTT TTTGTTTGTG ATTTCATTTA GATTTTTATT 201 TCTATGATTT CTTAGCATGA AATACAATTT TTGGAGAAAC AACTAGCAGT 251 TTTAAAAACA AAACTTGAAT TTTGAGAAAT TCAAAGATGT TATATATATA 301 TGTCAAAATT TAACAATTAT TCTTCTAAAT CATCCGGATT CCGTTTACAT 351 GTACACATCT ACAATTTTCA ATTGAGGTAT TCTTGTTTTG ATGCCTTTGA 401 GACGAATAGT TTGATTGATA AAAAAAATTC TAACCAATAT GATATATAAA 451 GTTTATTTTC TTTTTGTCAA ACCATACTTT ATACTATGTA ACTTTTTTAA 501 GAGATTATTG AAAATAGTTT ATTTATAAAA TAGTAACCTA TTGTTGAATT 551 AAAAAAAAAA AAAAAATTGT AAATCGTGTT TGCAAACGAC ATGTGATTTA 601 TCTTAGTTTA JXAACTAGCTG ATATTCTTCflAATCGACTGT TCTTATAAGT 651 AATCAACCAA I IAUCAICAA ICACAAIAAÄ TTGTAAACAC TTCAATGAAA 701 ATGGTGATTT TAAAGAATAT GTTTTACTTA TGTTATGAAC TATCTCAAAT 751 TTGTGAAATA TTTCATAACT AATGTGGAAA ACTATATAAC CCCTCCATAC 801 AAAACGTAAG TAAAATTTAT GAAATCCTAT CATTTTTAAA GGTTAAACCA 851 ATCAAAAAGT AATAATTCTT GGTACTTGCA ATATTTTTGT CATTATATTT 901 TAGTTTATTA ATTTTATTTT GATTAAATGG TTTTAGATCC ATCAGTTATG 951 GAGATCGCAG TTATAGCTGT AGACGATCCG AAGAAAGCAT TATCTACTCT 1001 AAAAATTCAA CGAGACAATA TAGATCTCAT AATCACAGAT TATTATATGC 1051 CTGGTATGAA CGGTTTACAA CTCAAAAAAC AAATCACTCA GGAATTTGGA 1101 AATTTACCGG TCTTAGGTAA CATTTTTTGT TCTTTACAAC TTAAATTAAA
5'TGAAGAATATCAGCTAGTTT   3'    REVERSE
DNA Sequence	
Sequence Length:	LS5S nt
Reading frame:	+ 1
Current Oligo Length:	2 L nt
Position:	356
XD                    tm:	59.3°C
		Selected Oligo	Position	Length
ie'b		Forward Primer	259	LS
XD	u	Reverse Primer	32S	LS
jT)	B	Upper Oligo	-----	—
JD   U		Lower Oligo	294	22
XD		PCR Product	87 nt	
#          Feature                          Location	
L    source	-LS..LSS0
2     CD5	1..651
	
p;s
350
tm:      57.1
,260              .270              ,280              ,290              ,300              ,310              .320              ,330              .340 .......'.........'.........'.........'.........'.........'.........'.........'.........'.........
350               ,3G0               ,370 .........'.........'........
cc~gg:~g~ga:~ac~ca
i-hhi-hi-i-hi-i-hi-hhi-hi-i-hi-i-hi-hhi-hi-i
i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-i-
—AA~G C C~G G C_G~GAC_AC_CAC----------AAG GA~G G~A—GAG C C_A_G~G G G AAG A_G AGAAAAACAAAC G G G GAG GAC GA~G G C~AA—ACA-G AAC AAAt AGt AGAG A« AAGTGAtt~C
AATTACGGACCGACACTGATGACTGAAAAATTCCTAC C ATAACTC G G ATACAC C CTTCTACTCTTTTTGTTTG C C C CTC CTG CTAC C GATTAATGTAACTTCTTTGTCCTCTCTGCTTCACrGGAG
.........ACTCGGATACACCCTTCTACTC
..............................CCrCCTGCTACCGATTAA
LMPGCDY5LFKDtIEPMWEDEItHKRGGRW             ITLHKqqRR5DL
T5TÍ"
1
nr>
Search for Primers & Probes
Search Options      Subsearches
Search in:         @ + Strand @ - Strand
Search Mode:   © Select            Verify
■ Complex Substrate
© PCR Primers Compatible with the        Forward Primer          Reverse F   Tier
O TaqMan Probes & PCR Pairs Compatible with the O Upper Probe
I Lower Probe
O Molecular Beacons & PCR Pairs O Nested Primers O Sequencing Primers O Hybridization Probes siRNA Probes
After successful! search show:    All Results
u
(	Search	>
		
(	Cancel	)
		
t	Apply	)
ŕ Parameters j
Ranges (   Defaults    )
r>r>
Search for Primers & Probes
Search Options      Subsearches
Search method: Compatible Pairs
g Eliminate Ambiguous Bases 0 Duplex-free Oligonucleotides ® Highly Specific Oligonucleotides (3'-end Stability) Q 5*-end Stability G siRNA Internal Stability 0 Oligonucleotides with CC Clamp ® Oligonucleotides within Selected Tm Limits B Hairpin-free Oligonucleotides ® Eliminate Mono- and Di-Nucleotide Repeats 0 Detect Sequence Repeats @ Eliminate Frequent Oligonucleotides @ Omit High Secondary Structure Regions in the Template 9 Check Primers/Probe Sequence Constraints 5j Restrict the Number o; C Bases @ Eliminate False Priming Oligonucleotides and _ Continue Above Search in Other File(s) Consensus Primers
f     Search    )
Cancel Apply      )
( Parameters )
Ranges I    Defaults)
e
O^
PCR
File: Human 4E.seq
Optimal Annealing Temoerature: S0.8 °C (Max: 66.3 °0
	Posti on and Length		Tm[°q	CCpé]	P.E.*	Score	
Product	862		78.9 56.9	29.6 45.5	n/a 471/471	697 840	
Forward Primer	918 1753 979	22 27 24					
Reverse Primer Upper Ol i go			55.3 56.5	29.6 33.3	489 / 489 479 / 479	834 917	
Lower Oligo	1694	23	55.4	39.1	457 / 457	841	
Product Tm - Reverse Primer T Primers T~ difference: L6°C
23.6
C Comments
	Concentration	
Forward Primer	200.0	nM nM nM nM
Reverse Primer	200.0 200.0	
Upper Oligo		
Lower Oligo	200.0	
Monovalent Cation	50.0	mM
Free Mg[2+)	0.7	mN'
Total Nal + j Equivalent: 155.8 mM
Q 0 í                                                             Selected Primers
File: BRCA2 gene.seq
AY436640:15917R20		
5' CACCTACATATTACCCCACA 3'		
Length:		20-mer
5core:		914 points
3' Position:		15917
^m ^-m ■	53.1	53.8 BC
AC/Ag (25 *Q:	-2S.6	-2S.5 kcal/mol
A5/As:	-430.5	-419.6 cal/ůK*mol
AH/Ah:	-157.0	-153.6 kcal/mol
3'AC:		-6.9 kcal/mol
Degeneracy:		______1
P.E.#:		(477/477)
1/E:		~      5705 nmol/A2Go
31.0 M9/A2So		

AY436640:1543SF22			
5'	CAATATATACCGTAGTCCCCTA 31		
Length:			22-mer
Score:			S02 points
51 Position:			1543S
T    ft 1 m > Lm ■		53.4	52.6 °C
AC/Ag (25 '	Q:	-30.5	-29.2 kcal/mol
A5/As:		-472.1	-449.5 cal/aK*mol
AH/Ah:		-171.3	-163.2 kcal/mol
3'AC:			-6.5 kcal/mol
Degeneracy			______1
P.E.#:			(443/443)
1/E:			"    4^63 nmol/A2C0
31.1 Mg/A26o			
Priming Efficiency PE
DUPLEXY
DIMER intermolekulární HAIRPIN intramolekulární
eoe
Current Oligo Duplexes
Tile: HRCA2 gene.seq
Current Oligo 2L-mer [5042]
=i
[Current t Oligo] - The most stable 3'-dim er: ŕ of hydrogen bonds = LO: AC = -0.7 kcal/mol
5' GAATTACATAAATTCAAATTA 3'
III II  II  III 31 ArTAAACTTAAATAGATTAAij 51
[Current- Oligo] - The most stable 3"-dim er: #of hydrogen bonds = LO: AC = -7.3 kcal/mol; Tm = 2.9°C
5' TAATTTdAATTTATCTAATTC 3' I III I      II III 3 '   CTTAATCTATTTAAGTITAAT 5 r
The most stable dinier overall: ŕ of hydrogen bonds = LO: AC = -7.4 kcal/mol: Tm = 2.2ŮC
5' ĽAArTAĽATAAATTCAAATTA 3' I III I      II III 3 " ATTAAACrTAAATAGATTAAi] 5 '
Hairpin: loop = S nt; AC = -3.0 kcal/mol: Tm = 54.6 °C
5 " ĽAATTAC-, II III        A 3 ' ATTAAACTTAAAT-1


eoo
File; ERCÁ2 gene.seq
Current Oligo 21-rner (50421
Current Oligo Hairpin Stems
L #of paired bases - 5; loop =
5C42   GAATT   5046
ŮC - -3.0 kcal/rnol; Tm = S4.6 *C
S'GAATTAG-i
^C56   CTTAA  5052      3 ATTAAACITAAAT
2* #of paired bases = 6; loop = 5 nt; ŮG = 0*2 kcal/rnol; Tm = 5043  AATTAGA  5049    5 ' GAATTAGATA-» MM    II               1          MM    II       A 50É1   TTAAACT  5055    3 ' ATTAAACTTA-	21.7 °C
	
3. #of paired bases = 4; loop ■ 2nt;ÜC ■ 0*9 kcal/rnol; T
5052  AATT 5055       5 f GAATTAGATAAATTC
- 87 *C
5061   TTAA  5058
3 ATTAAA
►c
h
666     Reverse Primer False Priming Sites
File:M13MP18
Reverse Primer M13MP18:6310R19 (positive strand)
Priming efficiencv of the perfect match is 482 (above the thresho
Priming efficiency: 482 (above the threshold)
5'(6328)    GGTTTTCCCAGTCACGACG   (6310)3'
lllllllllllllllllll 3'(6328)   ccaaaagggtcagtgctgc   (6310)5
Priming efficiency: 244 (above the threshold)
5'(6328)    GGTTTTCCCAGTCACGACG   (6310)3' III    MM       MIHI 3'(626)   agcaaatggtc—tgctgc   (610)5'
Priming efficiency: 193 (above the threshold)
5'(6328)    GGTTTTCCCAGTCACGACG   (6310)3'
I    II       MINIM    III 3'(5125)   tctaagtggtcagtg-tgc   (5108)5'
Priming efficiency: 191 (above the threshold)
5'(6328)    GGTTTTCCCAGTCACGACG   (6310)3' II    I    lllllll    MM 3'(808)   gtaatatggtcagtcctgc   (790)5'
Priming efficiency: 179
5'(6328)    GGTTTTCCCAGTCACGACG   (6310)3'
3'(6315)   tgctgcaacattttgctgc   (6297)5'
Reverse Primer M13MP18:6310R19 (negative strand)
Priming efficiency of the perfect match is 482 (above the threshol
Priming efficiency: 105
5'(6328)    GGTTTTCCCAGTCACGACG   (6310)3'
MIMI   I                  MM
3' (5744)   ccaaaaagcgggaaactgc   (5762)5'
Forward Primer Composition
File: BRCA2 gene.seg
Forward Primer AY436640:6275F19
	64.2° 56.5° 70.8° 56° 81°	(neares (neares (2(A+T)°	t neighbor method? t neighbor method]
			(96GC method? t 4(G+C)° method]
Tm(RNA)(lMNa]		(96GC method?	
Tm(DNA:RNA)(lMNa]	74.7°	(96GC method!	
A260/A280	1.59 5.8K	(single strand?	
Molecular Weight		(one strand]	
Molecular Weight	11.7K	(two strands?	
ug/OD	47.4	[dsDNA]	
Number &%
A	2	(10.5961
C	5	126.396]
C	4	[21.1961
T	8 10 9	(42.1961
A + T C + C		(S 2.696] [47.4*:
DNA Melting Temperature in Various				
Salt and Formamide Concentrations (°C)				
[mM]   |	xSSC	096	1096	5096
1	O.006	24.8	18.3	-7.7
10	0.06	41.4	34.9	8.9
50	0.3	S2.8	46.3	20.3
165	1	60.8	54.3 S8.6 60.9 64.3	28.3 32.6 34.9 38.3
330	2	65.1 67.4		
500	3			
1000	6	70.8		
Approximate tm of the mismatched oligo Mismatchtm =7^ - 1.2P6mismatch)0
mism.#	64.2	mism.# 3	»m
0			4S.3
1	57.9	4	39.0
2	51.6	5	32.7
eoo
Oligonucleotide Database
Filc: NewDatabase.cdb
&
S:
§L
Ü
O
o o
o o o o
Date
ID Number
21 22 23 24 25 26 27 28
12/02/06 12/02/06 12/02/06 12/02/06 12/02/06 12/02/06 12/02/06 12/02/06
AY436640 AY436640 AY436640 AY436640 AY436640 AY436640 AY436640 AY436640
S916R19 5916R20 S937R21 5937R22 469SU22 5325U22 S786L23 S860L19
Sequence
AATCCCTCCCTTTACTCTC CAATC C CTC C CTCTACTCTC TCAATTTCTTTACCTTCCCAT TTCAATTTCTTTAC CTTC CCAT TCCCTTAACAAAACTAATCCAT AATTAC CTCTTTCTTATC C CAA CTCTCCCTACAACATTATCACTC AACAAC CAAAC C CAAC CTC
Oligonucleotide Sets  (64)
Forward
Primer
l
Upper
Ol i go 3
Lower Ol i go
39	9
33	9
61	9
48	9
23	25
24	25
14	25
15	25
16	25
17	25
18	2S
28 28
17 11 11 11
Checked Set of nested primers
This database is linked to BRCA2 gene.seq
o^^
Restriction Enzyme Sites in Protein
File: BRCA2 gene.seq
# 33  EcoRI
Enzyme |ř240O |ř2M0 ,22800 ,2IO0O ,23200 ,23400 ,23MO .21H0O ,24000 ,24200 ,24400 ,24600 .24H0O  .2JO0O ,21200 ,21400 ,21600 .21800 ,26000 ,26200 ,26400 ,26600  ,26ftOO
34   EcoRV
35   EsP3l
36   Fsel
37   Fspl
38   Gsul
39   Hindi
L
40   Hpal
41   Kpnl
42   Mlul
43
N'unl
44  Nael
45  Narl
46   Ncol
47  Ndel
#    Enzyme
41   Kpnl
42   Mlul
43   Muni
44   Nael
45   Narl
46   Ncol
47   Ndel
48   Nhel
•"___«■—■
Site
#Cuts   Positions & Fragment Sizes
CT2VpzY6	8      -
	
TRIRVyA?	5
QL3Nawl5	10     -
	
AC2PÄXR6	7
	
CA2APZR6 PW3HCWM5 HM2lawY5	1 4 2
AS2LAX-6	16
	
21253
629
22233
21287
351
21823
623
20043
22361
20366
22276
369
402
23654 25387 22674 23620 25273 23084 26398 24864 22S46 24541 22631 24083 26045
68
1219
2824
355
714
597
23059
24593
336
1211
322
312
30
23722        52
26606 22851 25498 576 23975 351 2S987 187 23681      1286
22882 887 25752 23705 229S3 185 24395 288 2607S        210
23774
26074 24326 26174 24967
23769
23138 24683 2628S
237   24011
585   24596
162   24758
106   26180      244   26424  23033
282   24608      242   24850        72   24922
420   26594  22863
86   25053       573   25626       149   25775
531   24300  25157
88   23226        27   232S3
151   24834      273   25107
372   26657  22800
-l ir i n
■ "__-»-"" ' B
■   **-___-»-»"""-
"»" '__-t-t  r  nu
461   23714 536   25643
' nr-___-t a nni-
T
c
Search: 22454 to 27004   End Cut Type: Blunt, Odd, 3'-overhang, 5'-overhang
0 O        Hybridization Time
File:M13MP18		
		
DNA Length:     |	»	nt.
Concentration:	200.0	nM M9/mL
	1.298	
[\     Vň= 45,4 sec
T    = 3 rnin 47 sec
eo^
Concentrations
File 6RCA2 gene.sec
@ Constant Concentration
Constant Volume
© Current +Oligo:           5.08 nrnol/ODt 32.S pg/OD
O Current -Uligo;            4.b/ nrnol/UDt JU.y M9/UU Q Entire Sequence (d$): 0.001 nrnol/ODt 48.1 pg/OD
Q Forward Primer:           5.98 nrnol/ODt 35.0 M9/OD
O Reverse Primer:            S.31 nrnol/ODt 34.0 pg/OD
C PCR Product (ds):        0.146 nrnol/ODt 48.1 pg/OD
Q Upper Oligo:                 4.83 nrnol/ODt 31.2 pg/OD
Q Lower Oligo:                 4.67 nrnol/ODf 30.9 M9/OD
1	32.5   ug
	
or	1.0 | OD(260)
or	5.084 i nmol
	
in	508.4   u|_
yields	LO.O   uM
...nejlepším učitelem je praxe...