~ORKD3XO]QtJHORYiHOHNWURIRUp]DJHQRPRYp'1$EDNWHULt
3XO]Qt HOHNWURIRUp]D MH HOHNWURIRUHWLFNi PHWRGD XPRXMtFt QD UR]GtO RG NODVLFNp
HOHNWURIRUp]\HIHNWLYQtGOHQtPROHNXO'1$YWtFKQHNEDGRYHOLNRVWLQNROLND0E
3L SXO]Qt HOHNWURIRUp]H VH SHULRGLFN\ PQt RULHQWDFH HOHNWULFNpKR SROH 3L S$VREHQt
HOHNWULFNpKRSROHVHPROHNXO\'1$SURGOXXMtD]DURYQiYDMtYHVPUXHOHNWULFNpKRSROHD
PLJUXMtVPUHPNDQRG%\OR]MLWQRHSRRGVWUDQQtHOHNWULFNpKRSROHVHSURGORXHQi
PROHNXOD '1$ YUDFt QD]SW GR UHOD[RYDQpKR VWDYX 'RED WpWR UHOD[DFH ]iYLVt QD GpOFH
PROHNXO\ 3HULRGLFNp ]PQ\ RULHQWDFH HOHNWULFNpKR SROH ]S$VREXMt UHOD[DFL D RSUQp
SURGOXRYiQtD]DURYQiYiQtPROHNXOSRGOHRULHQWDFHQRYpKRSROH
3ULQFLS SXO]Qt HOHNWURIRUp]\ MH QiVOHGXMtFt 3L S$VREHQt SUYQtKR SROH VH PROHNXOD
]DURYQi YH VPUX WRKRWR SROH D ]DQH PLJURYDW Y JHOX 3UYQt SROH MH RGVWUDQQR D ]DQH
S$VRELWGUXKpSROH'1$PXVt]PQLNNRQIRUPDFLDUHRULHQWRYDWVHQH]DQHPLJURYDWY
GUXKpPHOSROLýDVQXWQSURWXWRUHRULHQWDFLUHRULHQWDQtDVMHYHOPLFLWOLYQDYHOLNRVWL
PROHNXO\9WtPPROHNXOiPWUYiUHRULHQWDFHGpOHQHPHQtP=DWtPFRYWtPROHNXO\VH
MHW UHRULHQWXMt PHQt X PRKRX ]DtW PLJURYDW JHOHP -HVWOLH GRE\ S$VREHQt RERX
VWtGDMtFtFKVHSROtMVRXVWHMQp'1$PLJUXMHURYQJHOHPFLNFDN]S$VREHP
3RXtYDQp WHUPtQ\ 6ZLWFK LQWHUYDO SXO]Qt DV  GRED SR NWHURX MH NDGp ]H
VWtGDMtFtFKVHHOHNWULFNFKSROtDNWLYQt5HRULHQWDQt~KHO~KHOPH]LGYPDVWtGDMtFtPLVH
SROL ,QYHU]Qt SROH  8VSRiGiQt SXO]Qt HOHNWURIRUp]\ NG\ VH VWtGDMt SROH RULHQWRYDQi Y
RSDQpPVPUXUHRULHQWDQt~KHOMH
3RXtYDQp KPRWQRVWQt VWDQGDUG\ NRQNDWHPHU\ SLSUDYHQp ] '1$ EDNWHULRIiJD 
PDMt REY\NOH    PHU$ ODGGHU NRQNDWHPHU\ ] OLJRYDQFK SOD]PLG$ FKURPR]yP\
6DFFKDURP\FHVFHUHYLVLDHQHER6SRPEH
3L StSUDYH Y]RUN$ '1$ YWtFK QH  NE MH QXWQp PROHNXO\ FKUiQLW MDN SHG
PHFKDQLFNP SRNR]HQtP S$VREHQtP VWLQFK VLO WDN SHG QXNOHRO\WLFNRX GHJUDGDFt
EKHP L]RODFH . WRPXWR ~HOX VH SRXtYi VSHFLiOQt PHWRGD L]RODFH SL NWHUp MVRX EXN\
QHMSUYHIL[RYiQ\YQt]NRWDMtFtDJDUy]HDWHSUYHSRWRPSURYiGQDO\]HDSXULILNDFH'1$
3ULQFLSL]RODFH'1$
2EMHNW.PHQ\6WDSK\ORFRFFXVDXUHXV
3RVWXS
,]RODFH'1$SURSXO]QtJHORYRXHOHNWURIRUp]X3)*(
 POî<7PHGLDQDRNRYDWEDNWHULiOQtNXOWXURX]KRGNXOWXU\DLQNXERYDWSL
&GR2'

 FDKRGLQ\QDWHSDFH
 3LGDW  O0('7$DNXOWXUX]FKODGLWQD&PLQ
 &HQWULIXJRYDWSLPLQ

&PLQFHQWULIXJD.
 'YDNUiW SURPW  PO SURPYDFtKR UR]WRNX ]FKOD]HQpKR QD OHG  P0 7ULV&O
P0('7$P0(*7$01D&OS+DUHVXVSHQGRYDWYOVWHMQpKR
UR]WRNX
 OEDNWHULiOQtVXVSHQ]H]DKiWYPLNUR]NXPDYFHQD&PLQSLGDWO
O\]RVWDILQX ]H ]iVREQtKR UR]WRNX  PJPO O\]RVWDILQ SLGiYDW SRX]H N
6WDSK\ORRFRFFXVDVPtFKDWVHOORZPHOWLQJSRLQWDJDURVHUR]WRNYP0
7ULV&OP0('7$S+SHGHPY\WHPSHURYDQpQD&
 6XVSHQ]LU\FKOHSHSLSHWRYDWGRNRP$UHNWYRtWNDSRODXORLWQDPLQSL
&
 9]RUN\SHQpVWGRPOO\]DQtKRUR]WRNXP07ULV&OP0('7$01D&O
%ULM1ĎHR[\FKROiW/DXU\OVDUNRVLQS+JO\VR]\PX
]iVREQt UR]WRN PJPO  J 51DV\ ]iVREQt UR]WRN  PJPO ,QNXERYDW ]D
PtUQpKRWHSiQtSL&QDYRGQtOi]QLKRG
 /\]DQt SXIU Y\PQLW ]D GHSURWHLQL]DQt  P0 ('7$  P0 (*7$
ODXU\OVDUNRVLQS+DSLGDWJSURWHLQDV\.]iVREQtUR]WRNPJPO
,QNXERYDWKRGSL&]DPtUQpKRWHSiQt
 îSURPWYPO7(S+SL&7(SXIUY\PRYDWSRKRGLQiFK]D
PtUQpKRWHSiQtQHERQHFKDWVWiWYG\KRG
 $JDUy]RYpY]RUN\VHPRKRXVNODGRYDWPVtF$Y7(SXIUXSL&î]DPVtF
Y\PQLWQHERGHOtGREXY0('7$S+
5HVWULNQtWSHQtYHONFKIUDJPHQW$'1$YDJDUy]H
 3UR UHVWULNQt WSHQt Xt]QRXW FD îî PP EORHN D SHQpVW GR (SSHQGRUI
]NXPDYN\
 3LGDWOîUHVWULNQtKRSXIUXOYRG\D8UHVWULNWi]\,QNXERYDWSL
SRDGRYDQpWHSORWSHVQRF1DWSHQpY]RUN\VHPRKRXStPRQDQiHWQDJHO
3tSUDYDJHOXDQDVWDYHQtHOHNWURIRUp]\
 3LSUDYLWDJDUy]RYJHOYî7$(SXIUX
 1DQpVWY]RUN\QDWSHQp'1$GRMDPHNQDJHOXD]DOtWORZPHOWLQJDJDUy]RXY
î7$(SXIUXY\WHPSHURYDQRXQD&
 2SWLPiOQt SRGPtQN\ SUR UR]GOHQt IUDJPHQW$ FKURPR]RPiOQt '1$ V &+()'5,,
]Dt]HQtP3XO]QtDV\VOLQHiUQtY]HVWXS.RQFHQWUDFHDJDUy]\/DFKHPD
7HSORWD&1DSWt9'REDHOHNWURIRUp]\KRGSURJHOGpON\FP
 2EDUYLWJHOYUR]WRNXHWKLGLXPEURPLGXJPOKRGLQ\RGEDUYLWYGHVWYRGD
IRWRJUDIRYDWSRG89VYWOHPQP
3R]QiPN\
 î<7PpGLXP7U\SWRQJ<HDVWH[WUDNWJ1D&OJYRGDGRPO
S+
 /DXU\OVDUNRVLQVWHULOL]RYDWILOWUDFtRVWDWQtUR]WRN\VWHULOL]RYDWDXWRNOiYRYiQtP
Úloha: Izolace spontánních mutant rezistentních ke streptomycinu metodou
gradientních ploten
Princip: Molekulární podstata spontánních a indukovaných mutací je stejná. Liší se však ve
frekvenci. Frekvence spontánních mutací je podstatně nižší. Tím se také liší od fenotypové
modifikace, neboť ta proběhne prakticky současně ve všech buňkách. Spontánní mutace - rezistence
k antibiotikům probíhají dvěma způsoby. Buď se rezistence k antibiotikům vytvářejí postupně
v několika stupních (např. u penicilinu) nebo hned v prvním stupni získáme mutanty rezistentní
k různým koncentracím antibiotika.
Upozornění: očkování provádět ve sterilním prostředí flow-boxu; použitý materiál pečlivě roztřídit
a odnést do umývárny.
Objekt: Kmeny Staphylococcus aureus citlivé ke streptomycinu: kmeny S.a .8511-A;
S.a. 8511-B; S.a. ISP- A; S.a. ISP- B.
Postup: První den.
1. Z 18 hod. kultury vyrostlé na MPA agaru, odebrat 5 kliček a důkladně resuspendovat ve
3 ml MPB. Je nutno vyjít z husté bakteriální suspenze (cca 109
buněk/ml), protože
frekvence strR
mutantů je velmi nízká.
2. Z takto připravené husté kultury provést rozsev ze zředění 10-6
, 10-7
, 10-8
vždy na 3 plotny
s MPA, pro stanovení celkového počtu buněk v cm3
(tj. titr buněk). Kultivace při 37 °C/24
hod.
3. Připravit gradientní plotny (Obr. 1) se streptomycinem o výsledných koncentracích: 10, 50,
100 a 500 g/ml. Pro přípravu zásobního roztoku rozpustit 0,5 g krystalického
streptomycinu v 5 ml sterilní destilované vody (přidávat do roztavené MPA půdy o teplotě
max 55 o
C).
Obr. 1
4. Provést rozsevy po 0,1 ml na gradientní plotny (vždy 3 plotny od příslušné koncentrace, viz
obr. 2) a pečlivě rozetřít hokejkou po celé ploše.
Obr. 2
5. Naočkované plotny inkubovat dnem vzhůru při 37 o
C /24 hod
Druhý den.
Jednotlivé kolonie za linií kompaktního nárůstu přenést do mikrozkumavek s 0,5 ml MPB.
Přeočkovat na plotny s různými koncentracemi streptomycinu (5, 10, 25, 50, 100 a 500 g/ml)
formou proužků (viz obr. 3). Příprava ploten: Do známého objemu roztaveného MPA a
vytemperovaného na max. 55 °C přidat vámi vypočítané množství zásobního roztoku streptomycinu
tak, aby bylo dosaženo požadované výsledné koncentrace.
Obr. 3.
Gradientní plotna
37 o
C /24 hod
MPA + streptomycin
1 proužek = 1 kolonie
resuspendovaná
v 0,5 ml MPB
Kompaktní
nárůst
Třetí den.
Z výsledků stanovit nejvyšší koncentraci, ke které je kmen rezistentní a určit frekvenci mutací k
jednotlivým koncentracím streptomycinu.
Výpočet frekvence mutant: F = titr mutant / titr buněk
Vypracovat protokol a odevzdat vyučujícímu. Protokol bude obsahovat: Název úlohy; Objekt;
Princip metody stručně; Výsledky (titry buněk, titr mutant....Závěr (hodnocení a diskuze o
výsledcích).
~ORKD)OXNWXDQtWHVWQDUH]LVWHQFLNHVWUHSWRP\FLQXDVWDQRYHQtPXWDQt
U\FKORVWL
)OXNWXDQt WHVW VORXt N WRPX DE\FKRP EH]SHQ UR]OLLOL ]GD SRG YOLYHP YQMtFK
]PQQFK SRGPtQHN GROR N I\]LRORJLFNp DGDSWDFL QHER ]GD QRYi YODVWQRVW EXQN MH
YVOHGNHP VSRQWiQQt PXWDFH 1HFKiPHOL U$VW SDUDOHOQ Y QNROLND ]NXPDYNiFK VWHMQp
PQRVWYtLQRNXODEDNWHULiOQtKRNPHQHQDSFLWOLYpKRNHVWUHSWRP\FLQXSRQNROLNEXQQFK
JHQHUDFtDSDNY\VHMHPHQDSORWQ\VHVWUHSWRP\FLQHPGRVWDQHPHYVOHGN\
DOROLRI\]LRORJLFNRXDGDSWDFLNWHUiMHPRQiDYHVW\NXVIDNWRUHPNWHUMLY\YROiYi
SDNVHYVN\WUH]LVWHQWQtFKNRORQLtQDMHGQRWOLYFKSORWQiFKtGt3RLVVRQRYRXGLVWULEXFtDV

[ D2
2
9047
EOROLRVSRQWiQQtPXWDFHNWHUpY]QLNDO\LYGREPLPRVW\NVHVWUHSWRP\FLQHPSDNVH
YVN\WUH]LVWHQWQtFKNRORQLtQHtGt3RLVVRQRYRXGLVWULEXFt]HKRSO\QHV
!![ D2
!2
9047
0XWDQtU\FKORVWXGiYiSUDYGSRGREQRVWHEXNDEXGH]DXULWRXGREXYXULWpP]QDNX
PXWRYDW8GiYiVHQDSMDNRSUDYGSRGREQRVWQDEXNXDJHQHUDFL
2EMHNW 6WDSK\ORFRFFXV DXUHXV +6  6WU8
 6WDSK\ORFRFFXV DXUHXV  6WU8

6WDSK\ORFRFFXVDXUHXV,636WU8
NRO'RNDWH]GDY]QLNOiUH]LVWHQFHNHVWUHSWRP\FLQXMHYVOHGNHPVSRQWiQQtPXWDFHQHER
I\]LRORJLFNpDGDSWDFH9StSDGHVHMHGQiRVSRQWiQQtPXWDFLVWDQRYWHPXWDQtU\FKORVW
6FKHPDSRVWXSX
 KRG NXOWXUD 6 DXUHXV 6WU
V
î
JPO VWUHSWRP\FLQX
 PO 03%
 PO 03%
 PO
 PO
JPO VWUHSWRP\FLQX03$  
.21752/$
   
 KRG LQNXEDFH SL  & D SDN Y\OtW FHO REVDK QD SORWQ\
03$  
,QNXEDFH    KRGLQ SL  &
î

 
 

 
 

.RQWUROD QD 03$ EH] VWUHSWRP\FLQX
YVHY  PO YH ]0/3J
SR  PO

î YVHY QD
03$  JPO VWU
]iV UR]WRN VWUHSWRP\FLQX  PJPO
WLWU SR LQNXEDFL
~ORKD.RQMXJDFHNPHQ(VFKHULFKLDFROL+IUD)

.RQMXJDFH MH SURFHV SL NWHUpP MH '1$ SHQiHQD ] GRQRURYp EXN\ GR UHFLSLHQWQt Y
G$VOHGNX NRQWDNWX EXQN D Y\WYRHQt NRQMXJDQtKR P$VWNX 8VNXWHQQt NRQMXJDFH O]H
GRNi]DW Y]QLNHP UHNRPELQDQW$ NWHUp QHPRKO\ Y]QLNQRXW MLQDN QH UHNRPELQDFt PH]L
JHQRPHPGRQRURYpKRDUHFLSLHQWQtKRNPHQH.RQMXJDFHX(FROLMH]iYLVOiQDStWRPQRVWLD
VWDYX)IDNWRUX)MHSOD]PLGNENWHUVHP$HDXWRQRPQUHSOLNRYDWYEXFHQHER
LQWHJURYDWGRKRVWLWHOVNpKRFKURPR]yPX3RGOHVWDYX)IDNWRUXVHR]QDXMtStVOXQpNPHQ\
2]QDHQt 6WDY)IDNWRUX 9ODVWQRVWL
)*
)IDNWRUQHQtStWRPHQY
EXFH
9KRGQUHFLSLHQWEKHPNRQMXJDFH
)
) IDNWRU MH StWRPHQ Y
F\WRSOD]P
0$H EW SHQiHQ NRQMXJDFt GR UHFLSLHQWQt
EXN\ SHQRV FKURPR]RPiOQtFK JHQ$ P$H
]SURVWHGNRYDWSLYHOPLQt]NpIUHNYHQFL
)
 ) IDNWRU QHVH VHJPHQW
EDNWHULiOQtKR
FKURPR]yPX
0$H EW SHQiHQ VSROX V DVRFLRYDQP
EDNWHULiOQtPVHJPHQWHPFKURPR]yPXP$H
]SURVWHGNRYDW SHQRV FKURPR]RPiOQtFK
JHQ$ SL VWHGQt IUHNYHQFL Y G$VOHGNX
LQWHJUDFH GR FKURPR]yPX Y KRPRORJLFNFK
REODVWHFK
+IU )IDNWRUMHLQWHJURYiQGR
EDNWHULiOQtKR
FKURPR]yPX
0$H SHQiHW FKURPR]RPiOQt ]QDN\ SL
Y\VRNp IUHNYHQFL RG SHYQpKR ERGX QD
FKURPR]yPX NWHU MH FKDUDNWHULVWLFN SUR
NDG+IU
2EMHNW
'RQRU (VFKHULFKLDFROL+IU+5HLFK WUH
OHX
SUR
DGH
WKL
VWUV
5HFLSLHQW (VFKHULFKLDFROL)
5 WUH
OHX
SUR
DGH
WKL
VWUU
'R UHFLSLHQWQtFK EXQN SHFKi]t VHJPHQW WUH
 OHX
 SUR
 DGH
 WKL

0DUNHUVWU]$VWiYiYHQGRJHQRWX
3RVWXS
 3tSUDYDPODGFKNXOWXUGRQRURYpKRDUHFLSLHQWQtKRNPHQH1DRNRYDWNOLNXGR
PO316PpGLDDLQNXERYDWSL&KRGLQGRORJIi]HU$VWX
 6PtFKDWNXOWXU\GRQRURYpKRDUHFLSLHQWQtKRNPHQHYSRPUXPOPOD
LQNXERYDW]DDHUDFHSLHWUQpPPtFKiQtQDYRGQtOi]QLSLWHSORW&KRGLQ\
 6RXDVQVWDQRYLWWLWUGRQRURYpKRNPHQH+IU+UR]VHYHPQDSORWQ\03$YH]HGQt



YG\SRSORWQiFK
 3HVYGLWVHHDQLNPHQ+IU+DQL)
QHURVWRXQDVHOHNWLYQtS$G.RQWUROXSURYpVW
YVHYHPSRPONXOWXU\]HGQp
QDSORWQ\0$VWUHSWRP\FLQJPO
WKLDPLQJPOHGQtSURYiGWYHI\]LRORJLFNpPUR]WRNX
 3R  KRGLQiFK LQNXEDFH Y\VHW QHHGQRX VPV QD VHOHNWLYQt S$GX SR  D  PO
YG\SRSORWQiFK
 +RGQRFHQtSRNXVXY\MiGLWIUHNYHQFLUHNRPELQDQW$QDSRHWEXQN+IU
äLYQpS$G\
316EXMyQ S$GDSURNRQMXJDFL
JOXNy]D J
%DFWREHHIH[WUDFW J
<HDVWH[WUDNW J
SHSWRQ J
1D&O J
.+32 J
.+32 J
+2GHVW PO
S+XSUDYLW01D2+
DXWRNOiYRYDWPLQ&
03$ PDVRSHSWRQRYDJDUNRPSOHWQtS$GD
0$ PLQLPiOQtDJDU
VORND$ YRGQtDJDUS+
VORND% îNRQFHQWURYDQUR]WRNVROt
1+&O J
1+12 J
1D62 J
.+32 J
.+32 J
+2GHVW PO
0J62Â+2 PO]0]iVREQtKRUR]WRNXVWHULOQSLGDW
SRDXWRNOiYRYiQt
VORND& JOXNy]DSLGDWPOQDPO0$
VORNĎ VWUHSWRP\FLQSLGDWGRNRQHQpNRQFHQWUDFHJPO]H]iVREQtKR
UR]WRNXPJPO
VORND( WKLDPLQSLGDWGRNRQHQpNRQFHQWUDFH JPO]H]iVREQtKRUR]WRNX
PJPO
3L StSUDY 0$ VPtFKDW VORN\ %  GtO  &  '  ( Y\WHPSHURYDW QD  & D
VPtFKDWVHVORNRX$GtO\