Bi9393 Analytická cytometrie Laboratoř cytokinetiky Biofyzikální ústav AVČR Královopolská 135 612 65 Brno e-mail: ksoucek@ibp.cz tel.: 541 517 166 Struktura kurzu n Přednášky - 9 lekcí o průtokové cytometrii (výchází z kurzu J.P. Robinsona, BMS 631, Purdue University - 1 lekce o mikroskopii - 3 lekce zaměřené na „microarrays“ n Cvičení Součástí kurzu není praktické cvičení. Přesto bude jedna přednáška věnována praktické výuce analýzy dat (učebna CBA, Kamenice 3, 6.p.). Vybraná zařízení budou demonstrována přímo v laboratořích BFÚ n Test Kurz bude zakončen zkouškou ve formě testu shrnujícího látku za celý semestr. Výsledek testu bude tvořit 75% celkového hodnocení. n Seminář Každý student bude prezentovat krátký seminář jehož téma bude konzultováno s přednášejícím a bude se týkat zaměření kurzu. Na základě této prezentace bude udělen zápočet a hodnocení vlastního semináře se bude také z 25-ti % odrážet v celkové známce. Seminář studentů n Téma semináře musí vycházet z probírané technologie a musí být schváleno přednášejícím. n Cílem je demonstrovat pochopení principů ze kterých vychází a jejich uplatnění v biologii. n Prezentace musí být připravena např. v PowerPoint(u). Prezentaci je nutné předložit v předstihu přednášejícímu ke konzultaci a posouzení. n Maximální délka prezentace je 15 minut a nesmí být kratší 10-ti minut. Seminář studentů – příklady témat n Kinetická měření pomocí průtokového cytometru. n Monoklonální protilátky a jejich použití v průtokové cytometrii. n Fluorescenční značky v průtokové cytometrii a mikroskopii. n Principy sortrování. n Zdroje excitace v průtokové cytometrii. n Analýza DNA pomocí průtokové cytometrie. n Metody detekce apoptózy. n Aplikace průtokové cytometrie při studiu bezobratlých živočichů. Informační zdroje – průtoková cytometrie n Practical Flow Cytometry, Howard M. Shapiro, Wiley-Liss; 4th edition n Cytometry: New Developments, Volume 75, Fourth Edition (Methods in Cell Biology), Zbigniew Darzynkiewicz, Academic Press; 4th edition n Průtoková cytometrie v klinické praxi, T. Eckschlager a kol., Grada 1999 Informační zdroje – průtoková cytometrie (metody a protokoly) n The Handbook of Flow Cytometry Methods n Current Protocols in Cytometry Informační zdroje – cytometrie (časopisy) n Cytometry Part A http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/jhome/33945 n Cytometry Part B: Clinical Cytometry http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/jhome/102019902 Informační zdroje – cytometrie (CD-ROM) Informační zdroje – (Internet) n Purdue University, Cytometry Labs http://www.cyto.purdue.edu/ n International Society for Analytical Cytology http://www.isac-net.org/ n Molecular Probes (Invitrogen) http://probes.invitrogen.com/handbook/ Informační zdroje - mikroskopie n Taatjes D. J. Cell Imaging Techniques, Methods and Protocols, Humana Press, Totowa, New Jersey, 2005 n Stephens D. Cell Imaging, Scion Publishing Ltd., 2006. Informační zdroje - microarrays n Microarray Analysis, Mark Schena, Wiley-Liss 2003 n Guide to Analysis of DNA Microarray Data, Second Edition, Steen Knudsen, Wiley-Liss 2004 n DNA microarrays: a molecular clonning manual. Bowtell D, Sambrook J., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2003. Obecný úvod do průtokové cytometrie n Základní principy, možnosti průtokové cytometrie a její aplikace n Historie Tyto částice mají něco společného … Komerční zařízení Co můžeme analyzovat pomocí průtokové cytometrie? n Počítat částice v suspenzi n Oddělit živé částice od neživých n Hodnotit 10*5 až 10*6 částic za méně než 1 minutu n Kvantifikovat rozptyl světla, ale i intenzitu fluorescence n Fyzicky separovat jednotlivé částice (populace) pro další analýzu Definice n Průtoková cytometrie (flow cytometry) – Meření vlastností proudících částic (buněk) n Průtokový sorting (flow sorting) – Separace částic (buněk) na základě parametrů měřených průtokovou cytometrií – také známo jako Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) Cytometry Publications/Year Historie barvení biologických materiálů Andrew Moldavan Není jasné zda Moldavan vůbec svůj „počítač buněk“ sestrojil. Ve svém, článku popisuje mnoho problémů, ale žádné výsledky. Friedman Friedman (1950) – kombinoval kyselý fuchsin, akridinovou žlut´a berberin pro detekci buněk nádorů dělohy pomocí fluorescenčního microskopu von Bertalanffy & Bickis Gucker - 1947 n Vyvinul průtokový cytometr pro detekci baktérií v aerosolu. n Utajená práce vynikala během Druhé světové války a byla publikována v roce 1947. n Cílem byla rychlá detekce vzdušných spór a baktérii během válečného konfliktu. n Instrument: Proudí vzduch procházel skrz osvětlenou komůrku. Jako zdroj světla sloužila lampa ze světlometu a pro detekci byl použit fotonásobič. Wallace Coulter n Wallace Coulter - Coulter orifice - 1956 - n (patent 1953) – měření změny vodivosti během průchodu buněk v suspenzi malým otvorem Jak počítat buňky? n Hemocytometer (Bürkerova komůrka) byla standardem pro počítání buněk do ~ 1950 n Rozměry jsou 3x3x0.1 mm. Obvykle jsou červené krvinky (1 x 10^6/mm^3 )počítány po naředění 1:200 n Leukocyty (5x10^3/mm^3) jsou ředěny 1:10 v roztoku lyzujícím červené krvinky n Statistická chyba: – koeficient variance (CV) je při 500 spočítaných buňkách 4.4% – chyba pipetování a ředění je ~ 10% Coulter Counter Coulter Counter Coulter Counter Richard Sweet Richard Sweet vyvinul elektrostatickou inkoustovou tiskárnu jejíž princip využil Mack Fulwyler pro svůj buněčný sorter. Mack Fulwyler- sorter Mack Fulwyler - sorter 1965 - Los Alamos National Labs – jeho sorter separoval částice na základě elektronicky měřeného objemu (stejný princip jako Coulter counter) a separoval pomocí elektrostatického vychýlení. Cílem bylo sortrovat červené krvinky,protože u nich byla naměřena bimodální distribuce buněčného objemu. Princip separace byl založen na principu inkoustové tiskárny Richarda Sweeta ze Stanfordu (1965) Mack Fulwyler- sorter Klíčové „cytometrické“ publikace K čemu to všechno je… například… n http://www.cytometryforlife.org/ Co tomu předcházelo… n Rozvoj techniky umožňující rychlou a reprodukovatelnou detekci cytometrických parametrů. n Nové vědecké poznatky vedoucí k definici vhodných diagnostických markerů. Shrnutí přednášky n Úvod do kurzu n Zdroje literatury n Historie průtokové cytometrie n Základní principy