Bi9393 Analytická cytometrie Lekce 2 Oddělení cytokinetiky Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i Královopolská 135 612 65 Brno e-mail: ksoucek@ibp.cz tel.: 541 517 166 Principy průtokové cytometrie a sortrování n Světlo n Fluorescence n Zdroje excitace, optické systémy a způsoby detekce fluorescence n Fluidní systémy Pojmy Fotometrie: n Světlo – elektromagnetické záření viditelné lidským okem (400-750 nm, nejcitlivější ~ 550 nm). Při měření pod 400 nm (UV, IF) se v podstatě detekci záření (radiometrie). n Energie záření se vyjadřuje v joulech n Světelný tok (radiant flux) je udávána jako hodnota energie v čase ve wattech (1 watt= 1 joule/sekundu) n foton – elementární částice. Popisuje je jejich vlnová délka, frekvence, energie a hybnost. Životnost fotonu je nekonečná (přesto vznikají a zanikají), existují pouze v pohybu. Má nulovou klidovou hmotnost, ale nenulovou energii, definovanou vztahem E = hν, kde h je Planckova konstanta a ν frekvence. Neboť má energii, působí na něj gravitace dle obecné teorie relativity a on sám gravitačně působí na okolí. (http://cs.wikipedia.org/wiki/Foton) n Energie fotonu je vyjádřena jako E=hn a E=hc/l [n-frequency (Hz), c – rychlost světla (3x10^8 m/s), l-wavelength (nm), h-Planckova konstanta (6.63 x 10^-34 J/s)] n Energie je vyšší při kratších vlnových délkách a nižší při delších vlnových délkách. Laser power n One photon from a 488 nm argon laser has an energy of E= 6.63x10^-34 joule-seconds x 3x10^8^ ^ ^ n To get 1 joule out of a 488 nm laser you need 2.45 x 10^18 photons n 1 watt (W) = 1 joule/second a 10 mW laser at 488 nm is putting out 2.45x10^16 photons/sec What about a UV laser? Polarization and Phase: Interference n Electric and magnetic fields are vectors - i.e. they have both magnitude and direction n The inverse of the period (wavelength) is the frequency in Hz Interference Rozptyl světla n Hmota rozptyluje světlo vlnových délek které není schopna absorbovat n Viditelné spektrum je 350-850 nm proto malé částice a molekuly (< 1/10 l) spíše viditelné světlo rozptylují n Pro malé částice byl popsán tzv. Rayleightův rozptyl (scatter) jehož intenzita je ~ stejná všemi směry n Rozptyl větších částic charakterizuje tzv. Mieův rozptyl. Jeho množství je větší ve směru v jakém dopadá světlo na ozářenou částici ð na tomto principu je založeno měření velikosti částic pomocí průtokového cytometru Rayleightův a Mieův rozptyl n Rayleightův rozptyl – molekuly a velmi malé částice neabsorbují, ale rozptylují světlo které má menší vlnovou délku než je jejich velikost (modré nebe - vzduch rozptyluje lépe kratší vlnové délky) n Mieův rozptyl je charakteristický pro částice větší než je vlnová délka světla (bílá záře kolem slunečního kotouče, mlžné světlo) Odraz a lom Snellův zákon n Při šíření záření z prostředí opticky řidšího do opticky hustšího prostředí se paprsky lámou směrem ke kolmici. n Při šíření záření z prostředí opticky hustšího do opticky řidšího prostředí se paprsky lámou směrem od kolmice. Brewster’s Angle A Demonstration of Reflection & Refraction - Snell's Law http://www.scienceshareware.com/snells_law_OV.htm Ohyb a rozklad světla Table of Fluorochromes Procesy interferující a detekcí fluorescence n Quenching - „zhášení“ fluorescence pomocí polárních rozpouštědel, těžkých iontů. n Bleaching – změna struktury fluorescenční molekuly vedoucí ke ztrátě fluorescence (působením světla a nebo chemickou interakcí. n Photon saturation – stav kdy množství molekul v excitovaném stavu odpovídá množství molekul v bazální hladině LASER(y) LASER vs. Arc lamp BD FACSCalibur system BD LSR II system Aria II Acousto Optical Beam Splitter AOBS® Basic fluidics Fluidics: BD FACSAria II Hydrodynamic focussing in the cuvette Shrnutí přednášky n Světlo n Fluorescence n Zdroje světla a optické systémy průtokového cytometru n Fluidní systémy