Aplikace průtokové cytometrie v klinické imunologii a hematologii Lukáš Kubala kubalal(a)ibp.cz Laboratoř patofyziologie volných radikálů BFÚ AV ČR Imunologie - Stanovení statusu imunitního systému • Vrozené nebo získané imunodeficience - monitorování HIV positivních pacientů a stanovení efektivity terapie - monitorování efektivity imunosupresivní terapie u transplantovaných pacientů • Monitorování autoimunitních onemocnění a efektivity terapie Hematologie • Diagnóza maligních onemocnění (hematopoetických neoplasmat) • Stanovení funkčních vlastností trombocytů Metodologické přístupy • Imunofenotypizace Stanovení zastoupení jednotlivých subpopulací leukocytu (obecně krevních elementů v krvi nebo kostní dřeni) • Funkční testy - Aktivace lymfocytů Změna exprese vybraných povrchových markrů (většinou receptory nezbytné pro funkci daného lymfocytu) Indukce proliferace (stanovení buněčného cyklu) Produkce cytokinů Stanovení cytotoxicity NK buněk a cytotoxických lymfocytů - Aktivace fagocytů (mikrobicidní aktivita) Produkce volných radikálů fagocyty Fagocytární aktivita - Stanovení funkčních vlastností trombocytů Imunofenotypizace • Stanovení zastoupení jednotlivých subpopulací leukocytu (obecně krevních elementů v krvi nebo kostní dřeni) na základě exprese vybraných povrchových antigénu případně v kombinaci s intracelulární produkcí cytokinu a expresí intracelulárních antigénu • Na základě rozptylu světla jsou buněčné populace rozděleny podle velikosti a granularity • Specifické monoklonální protilátky označené různými fluorochromy proti kombinaci vybraných antigénu umožňující rozdělení populací CD Antigény • Systém označení povrchových molekul leukocytu • Většina má alternativní názvy vztahující se k jejich funkci nebo struktuře • Dodnes definovány CD1 až CD339 • Některá CD jsou skupinami příbuzných molekul, a jednotlivé molekuly se označují písmeny (např. CD62L, CD62P, CD62E) • Zdroj informací o CD nomeklatuře - učebnice imunologie, www např. PROW www.Ncbi.nlm.nih.gov/prow/ Exprese vybraných povrchových znaků během vývoje B lymfocytu Vývojové stádium Exprese vybraných povrchových znaků Kmenová buňka CD34 Časný pro-B lýmf. CD34; CD45R; IL-7R; CD10;CD19;CD38 Pozdní pro-B lýmf. CD45R; IL-7R; CD10;CD19;CD38; CD20; CD40 Velký pre-B lýmf. CD45R; IL-7R; CD19;CD38;CD20;CD25 (rec. IL-2); CD40 Malý pre-B lýmf. CD45R;CD19;CD38; CD20; CD40 Vývojové stádium Exprese vybraných povrchových znaků Nezralý B lýmf. CD45R;CD19;CD20; CD40 Zralý naivní B lýmf. CD45R;CD19;CD20; CD21;CD40 Lymfoblast CD45R;CD19;CD20; CD21;CD40 Paměťová buňka CD45R;CD19;CD20; CD21;CD40 Plasmatická buňka CD135; CD38 Nezralé CD395% oc:ß+CD3+4+8+ malé klidové dvakrát-pozitivní tymocyty CD8 The different subsets represent different development stages of thymocytes. In the first step, CD4~CD8~(DN) thymocytes give rise to CD4+C08+(DP) thymocytes oc:ß+CD3+4+8- a:ß+CD3+48+ malé jedenkrát-pozitivní tymocyty O O Export do periferie The DP thymocytes mature further, to become CD4loCÜ8l0 CD4 O ď **,; CN O — 0 I**' v^l^PF^' Lymfocyty 1 1 1 1 1 200 400 600 800 100C l Forward Light Scatter Kontrola "čistoty" lymfocytárního ohraničení na základě FS a SS 03 (D (D -I—» -I—» 03 ü CO (D ■g ČO ■ ■■'■'■.'^.•'^•ií^:-J'; _■■. -:-ľ" ■,■.■-!;■*'■*■■ .'■'-"-.i-*" 'V atvÍ---""k'--'-'J' -i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—r 255 O) O LU Q_ ^- Q O CD45 FITC (log) Forward Scatter (linear) R1=monocyty (CD14+) R2=lymphocyty (CD45>monocyty) R3=granulocyty (CD45 I o • ; » * &k CD3 CD3/CD19 9 CelITvoe Conv Q1 CD3^CD19+ 10 Q2 CD3+CD19+ 0 Q3 CD3- CD19» 12 Q4 CD3+CD19- 78 Subset Name Conv %L Total T (CD3+) Lymphocytes Total B (CD19+) Lymphocytes 78 10 OK OK Operator defined markers are in effect. munofenotypizace v programu Simulset Krok 4 - Stanovení pomocných T-lymfocytů FITCCD3 PECD4 Events acquired: 14000 Data set:[1] Gated Evsnts:2206 Means: 160 28 FL1 EU Marker 76 73 u ■MMN* ' *>+!*, t' ■M' ■ »i» "IJ T CD3 CD3/CD4 Conv Q CelITvr» r*L Q1 CD3-CD4+ 12 Q2 CD&fCD4+ 43 Q3 CD3-GD4- 12 Q4 CD3rf au- 34 sübest Name Conv %L Total T (CD3+) Lymphocytes 77 OK T Helper (CD3+, CD4+) Lymphocyt es 43 OK Operator defined markers are in effect. munofenotypizace v programu Simulset Krok 5 - Stanovení cytotoxických T-lymfocytů FITCCD3 PECD8 Events acquired: 14000 Data set: [1] Gated Events:2105 FSC SSC Means: 151 28 F^t F^ Marker 76 73 CO . Vi I. . -•" ■ŕ .%aR§P • CD3/CD0 Q CellTvoe Conv Q1 CD3-CD8+ Q2 CD3+ CD8+ Q3 CD3- CD§~ Q4 CD3+ CDS-Subset Name 4 29 20 47 Conv %L Total T (CD3+) Lymphocytes T Cytotoxic (CD3+.CD8+) Lymphs 76 29 OK OK CD3 Operator defined markers are in effect. munofenotypizace v programu Simulset Krok 6 - Stanovení NK-lymfocytů FITCCD3 PECD56 Events acquired: 14000 Data set:[1] Gated Events:2077 F$C S$C Means: 151 28 FL1 FL2 Marker 76 73 o s ■ S V „IL V' rt »i m. **£* CD3 CD3/CD56 Q CelITvDe Conv %L Q1 CD3- CD56+ Q2 CD3+ CD56+ Q3 CD3- CD56-Q4 CD3+ CD56-Subset Name 12 6 12 70 Conv %L Total T (CD3+) Lymphocytes Total NK (CD56+^LvmDhocvtes 76 12 OK OK Operator defined markers are in effect. Příklad panelu antigénu stanovovaných při detekci plasmatických buněk CD138 Plasma cells CD38 Plasma cells, Activated T-cells CD56 Natural Killer Cells CD45 Human Leukocytes cKappa Cytoplasmic light chain cLambda Cytoplasmic light chain Více barevná imunofenotypizace Vizualizace jednotlivých populací FL4 FL4 FL4 barvy FL1 FL2 FL3 FL3 FL3 4 barvy FL1 FL2 Q FL2 2 barvy FL1 Tří barevná imunofenotypizace Kombinace protilátek značených FITC, PE a třetí protilátkou značenou např. Texas Red, Per CP, ALEXA barvy od Molecular Probes. Stanovení CD4 a CD8 lymfocytů c D 3 ■ 1 ■ .■■■■" T* "ŕf ŕ ■ ■ ■ " I ■ ■ ■ ' M ta i i i f •ffP i f i i i i i i i i i i i i rW i i i I i iF i fl i i f IFF i i i i i i i i i i i i i Fl SIDE SCATTER C D 4 ŕ ■ CD8 Tří barevná imunofenotypizace CD3, CD4, CD8 ti—i i i hlfl^M i iňi CD3 T ........I CD8 Mul I I I I ill I I I I III CD3 CD3-CD4-CD3-CD8+ CD3-CD4+ CD3+CD4+ Thlymf CD3+CD4- i/^T > Čtyřbarevná imunofenotypizace Antibodies labeled with FITC Antibodies labeled with PE Antibodies labeled with complex PE/Texas Red Antibodies labeled with complex PE/CY5 or PerCP Antibodies labeled with complex APC, CY5 or CY7 Antibodies labeled with ALEXA dyes from Molecular Probes Čtyř barevná imunofenotypizace CD3, CD4, CD8, CD56 CD3 Q CD56 E ■ ■ ■jfi s?» = -TO?' J ■ ■ ■vír '"íJf^u i i i i i mi 1 1 1 1 1 III i 1111 n m i 1111 m m Q CD3 v ■ 7 . .i ■ CD56 S' i i i i i 1111 i i i i 1111 i i i i i 1111 i i i i 11 111 CD3 U CD8 Příklad osmi barevná imunofenotypizace 8-color Antigen-Specific Immunophenotypí ng Ab Conjugate Laser CD2B PerCP-Cy5.5 438 CD45RAPE-Cy7 438 CĎ27 APC 633 Surface CD8 APC-Cy7 833 staining CD3 Pacific Blue 405 CD4AmCyan 405 Anti-IFHr FITC 488 Intracellular Anti-IL-2PE 488 staining Příklad 17 barevná imunofenotypizace Seventeen-colour flow cytometry: ____ unravelling the immune system CD4 T calls CD11a CD27 CD45RA Dim 4s Bright Stephen P Perfetto, Pratip K. Chattopadhyay and Mario Roederer 42 \1 CCR7 20 16 12 "6 s o1 fl m _lu Ifl D IL-2+IRM-y- □ IL-2-IFN-T+ □ IL-2+IFN-y+ Figure 6 | Visualization of polychromatic data using hierarchical trees. The data shown in this hierarchical tree were obtained from peripheral-blood mononuclear cells stimulated with staphylococcal enterotoxin B (for 6 hours in the presence of brefeldin A). The cells were subsequently permeabilized and stained for various cell-surface markers and intracellular cytokines. Branches of the tree segregate based on the expression level (for example, positive versus negative or bright versus dim) of a particular marker, and each terminal branch represents one fully gated subset. So, reading from the top. the branch below arrow 1 represents cells that are CD3+CD4+CD11adimCD27+CD45RA+CC-chemokine receptor 7 (GGR7)+. The frequency histogram below the tree indicates the relative proportion of cells in each subset that express interleukin-2 (IL-2) (blue bars), interferon-y(IFN--|) (green bars) or both (red bars). So, the GD11adimCD27+CD45RA+CCR7+cell population indicated by arrow 1 expresses only IL-2, which is consistent with a naive phenotype, Interestingly, IL-2 is expressed by a greater fraction of a naive-1 ike subset (CD11adimCD27-CD45RA+CCR7+ cells), in which cells have lost expression of CD27 but not other markers (arrow 2). In contrast, high expression of IFN-yis mainly observed in CD11 abri8htGD27" cells (arrow 3), a phenotype previously associated with effector memory T cells, Graphical representations such as this offer many options for data exploration, especially when the hierarchy can be rearranged to bring patterns into view, & FITC 488 n 532 _asGr excitation &33 wave ength 407 PE nn THPE D^^ Cy5PE rir-i nrn Cy5.5PE o^rin I I Cy7P£ - n APC Alaxa Fluor eao Cy7APC n I I. , CasBlu n Am Cyan —, n__ QD545 I i M- QDEB5 i—i — QD585 H QD605 ■ — QD655 n I—I QD705 .—.rni—i I—I n éo ^jytj, týftyffffff G4S AUGUST 2004 VOLUME 4 www.naturG.com/reviews/immunol Hematologie Použití imunofenoptypizace pro detekci hematologických onemocnění • Stanovení zastoupení jednotlivých buněčných inu • Stanovení stupně diferenciace • Stanovení monoklonální populace (B-lymfocyty) Haematopoéza mj Un com m itte d stem ce 11 q i ye s ri se to r r committed cells proerythroblast meqakaryoblast myeloblast basophilic erythro b last nnegakar i promyelocyte / oocyte + \ 'ŕ I normoblast reticulocyte + 0 erythrocyte t I platelets neutrophil basophil eosinophil monocyte '------------v------------' granulocytes monoblast lymphocyte Příklad identifikace buněk myeloidních linií proerythroblast o ./ to Q Optional: freeze directly ino BD FACS Lysing Solution Wash 5. Flow cytometry anti-IFNy FITC Shrnutí přednášky příklady aplikace průtokové cytometrie v klinické imunologii a hematologii • Imunofenotypizace • Funkční testy Změna exprese vybraných povrchových markrů (většinou receptory nezbytné pro funkci daného lymfocytu) Indukce proliferace (stanovení buněčného cyklu) Produkce cytokinů Stanovení cytotoxicity N K buněk a cytotoxických lymfocytu Produkce volných radikálů fagocyty Fagocytární aktivita