1
Principy microarrays II
Pavla Gajdušková
Analytická cytometrie, 1. prosince 2009
Obsah přednášky
Technologie přípravy microarrays
Oblasti použití microarrays v biologii
Úvod do statistického hodnocení dat
Příklady konkrétních aplikací z literatury
2
exprese proteinů (ELISA)proteinprotilátkyProtein
všechno dříve zmíněné,
sekvenování, anotace genů
všechno dříve zmíněnéDNATilling
místa vazby transkripčních
faktorů, modifikace histonů
DNA (ChiP
obohacená)
DNA (promotorové
oblasti ~ 1kb)
Promoter
míra metylace promotorových
oblastí
DNA (ovlivněná
bisulfidem sodným)
DNA (CpG islands)Metylace
detekce ,,Single Nucleotid
Polymorphysms"; změny v
genomu
DNADNA
(oligonukleotidy)
SNP
změny v genomu (zisk, ztráta
chromozomů nebo jejich částí
DNADNA (BAC vektory,
oligonukleotidy)
CGH
měření množství miRNAmiRNAoligonukleotidymiRNA
měření množství mRNA v
bunkách, nádorech ...
mRNA / cDNADNA (cDNA,
oligonucleotidy)
Expresní
... analýza čeho
Co se
fluorescenčně
značí a hybridizuje
Sondy
na microarray
Typ array
Oblasti použití microarrays v biologii
Analýza exprese a funkce
microRNA
Eva Lincová
Analytická cytometrie 1.12.2009
3
Analýza exprese a funkce
microRNA
1. Regulační RNA molekuly
2. Struktura, vznik a funkce miRNA
3. Databáze a predikce miRNA
4. Metody analýzy miRNA
- microarrays
- qPCR
- bead-based methods
- funkční analýzy
1. Regulační RNA molekuly
* Negativní regulátory translace a stability mRNA
* 1998 objev RNA interference (Andy Fire a Craig Mello)
* Význam RNAi:
* Obrana proti virové infekci
* Udržení genomové stability (umlčení
transposonů)
* Inhibice syntézy proteinů a
regulace vývoje organismu
* Zabránění transkripce ­ udržení
chromatinu v kondenzovaném stavu
* Experimentální umlčení genů
* Genová terapie
4
Proč studovat miRNA
* Kontrola buněčného cyklu, apoptózy, vývojových
a fyziologických procesů
(diferenciace kmenových buněk, hematopoéza,
hypoxie, vývoj svalstva, neurogeneze, sekrece
inzulínu, metabolismus cholesterolu, imunitní
odpověď, replikace virů)
* Evolučně konzervovaný mechanismus
* Tkáňově specifická a časově ohraničená
exprese během embryogeneze
* Změny v expresi při mnoha onemocněních
5
1. Regulační RNA molekuly
* siRNA ­ short interfering RNA (dsRNA prekurzory s perfektní
komplementaritou)
* miRNA ­ microRNA (dsRNA prekurzory s nedokonalým párováním)
* piRNA ­ Piwi-interacting
Kim V. N. Genes Dev. 2006;20:1993-1997
2. Struktura miRNA
* miRNA často kódována
introny genů
* Struktura vlásenky
* Seed region ­ 8
nukleotidů s perfektním
párováním
Lee RC, Feinbaum RL and Ambros V. 1993. The C. elegans heterochronic
gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell
75: 843-85
6
1. Dlouhý primární transkript ->
pri-miRNA (stovky nt-desítky
kbp)
2. Sestřih - RNasa III Drosha +
Pasha/DGCR8
­> pre-miRNA (70 nt)
3. Export (Exportin 5)
4. Maturace ­ Rnasa III Dicer začlenění
jednořetězcové
19-23 nt dlouhé miRNA do
komplexu RISC (tvořen
proteiny Argonaut)
5. Negativní regulace mRNA inhibice
translace nebo
degradace (P-bodies)
2. Biogeneze miRNA
2. Funkce miRNA
* Vazba
komplexu na
3´UTR
* Degradace
mRNA
* Inhibice
translace ­
iniciační
nebo
elongační
fáze
7
3. Databáze a predikce miRNA
* miRBase (09/09 ver. 14.0)
* http://www.mirbase.org/
2/11/2009
miRNA count: more than 10000 entries
(762 human)
3. Predikce cílových molekul
* Každá miRNA může regulovat až 100 různých molekul
* miRNA jsou krátké
* 3´UTR jsou dlouhé a nepříliš kvalitně osekvenované a
anotované
* Dosud málo ověřených cílových molekul
* Vazebná místa nejsou dokonale komplementární
* Klíčová oblast specifity je krátká (6-8 nt)
* TargetScan
* PicTar
* miRBase Target
8
4. Metody analýzy miRNA
* ... aneb co brát v úvahu při výběru metody
* ,,Throughput" ­ počet vzorků, miRNA
* Případné artefakty
* Cena (reagencie, materiál, instrumentace)
* Otevřená vs. uzavřená platforma (možnost
vytvářet vlastní assays)
* Možnost standardizace
Příprava vzorků
* Celková RNA
(Trizol)
* RNA obohacená
o malé molekuly
(komerční kity)
* Kontrola kvality
9
4. Metody analýzy miRNA
a. microarrays
b. qPCR
c. bead-based
methods
d. funkční analýzy
Zvýšení
afinity
10
b. qRT-PCR ­ SYBR Green
11
b. qRT-PCR - TaqMan
12
c. Bead-based methods
13
d. Funkční analýzy
* Luciferázové
reportéry
* Knockdown pomocí
modifikovaných
prób
* Overexprese miRNA
Shrnutí + ,,take home message"
* miRNA mohou regulovat až 30% genů
interakcí s 3´UTR na mRNA
* Metoda analýzy závisí na počtu
detekovaných miRNA a počtu vzorků
* Profil exprese miRNA se mění při celé
řadě onemocnění ­ diagnostický či
terapeutický potenciál
14
exprese proteinů (ELISA)proteinprotilátkyProtein
všechno dříve zmíněné,
sekvenování, anotace genů
všechno dříve zmíněnéDNATilling
místa vazby transkripčních
faktorů, modifikace histonů
DNA (ChiP
obohacená)
DNA (promotorové
oblasti ~ 1kb)
Promoter
míra metylace promotorových
oblastí
DNA (ovlivněná
bisulfidem sodným)
DNA (CpG islands)Metylace
detekce ,,Single Nucleotid
Polymorphysms"; změny v
genomu
DNADNA
(oligonukleotidy)
SNP
změny v genomu (zisk, ztráta
chromozomů nebo jejich částí
DNADNA (BAC vektory,
oligonukleotidy)
CGH
měření množství miRNAmiRNAoligonukleotidymiRNA
měření množství mRNA v
bunkách, nádorech ...
mRNA / cDNADNA (cDNA,
oligonucleotidy)
Expresní
... analýza čeho
Co se
fluorescenčně
značí a hybridizuje
Sondy
na microarray
Typ array
Oblasti použití microarrays v biologii
Použití microarrays ke studiu DNA
Komparativní genomická hybridizace
BAC arrays
oligo arrays
SNP arrays
tilling arrays (BAC a oligonukleotidy)
exon-specific arrays
(dříve i cDNA arrays používané pro expresi)
Genotypování
SNP arrays
Sekvenování
Re-Sequencing arrays
ChIP-Chip exprerimenty
tilling arrays (oligonukleotidy)
15
Komparativní genomická hybridizace (CGH)
molekulárně cytogenetická metoda, která slouží k analýze změn
obsahu DNA v živých organismech
(delece, zisk, amplifikace různých oblastí genomu)
porovnávání intenzity fluorescence zkoumaného vzorku DNA a
normálního diploidního vzorku DNA v různých místech
genomu
Komparativní genomická hybridizace (CGH)
Mantripragada et al. Trends in Genetics 2003
16
metafázní chromozomy
- dárce s normálním
diploidním karyotypem
DNA:
cy3 (červená)
zkoumaný vzorek
cy5 (zelená)
referenční DNA ­ 2n
From Szuhai K. presentation: Determination of Genomic Imbalances by
Genome-wide Screening Approaches
Komparativní genomická hybridizace (CGH)
rozlišení ~ 20MB
From Szuhai K. presentation: Determination of Genomic Imbalances by
Genome-wide Screening Approaches
Komparativní genomická hybridizace (CGH)
17
From Szuhai K. presentation: Determination of Genomic Imbalances by
Genome-wide Screening Approaches
Komparativní genomická hybridizace (CGH)
,,Array" komparativní genomická hybridizace
(Array CGH)
chromosomy nahrazeny body na mikroskopickém sklíčku,
které obsahují specifické DNA sekvence
18
Typy sond natištěných na microarray sklíčku
BAC klony až 32 000 BAC klonů na jednom sklíčku
~ 160 kb dlouhé úseky DNA
Oligonukleotidy 25 ­ 80 párů dlouhé oligonukleotidy
mohou pokrývat i celý genom (repetitivní
sekvence jsou vynechány)
známe polohu a pořadí všech sond v lidském genomu
Knihovny BAC klonů pro array CGH
BACPAC resources (CHORI)
Research Genetics (Invitrogen)
The Sanger Centre
http://www.geneservice.co.uk/home/
Cheung V. G. et al., Integration of cytogenetic landmarks into the draft
sequence of the human genome. Nature 409: 953 ­ 958, 2001.
Krzywinski M. et al., A set of BAC clones spanning the human genome.
Nucleic Acids Res 32: 3651-3660, 2004.
Greshock J. et al., 1-Mb Resolution Array-Based Comparative Genomic
Hybridization Using a BAC Clone Set Optimized for Cancer Gene Analysis.
Genome Res 14: 179-187, 2004.
http://www.resgen.com/resources/index.php3
http://bacpac.chori.org
19
Array CGH s použitím BAC klonů
Log2Rat = Log2 R/G
Log2Rat = 0 2 kopie
Log2Rat = 0.5 3 kopie ("gain")
Log2Rat = 1 4 kopie ("gain")
Log2Rat = 2 8 kopií ("amplification")
2464 BAC klonů UCSF HumArray3.1
Log2Rat = -1 1 kopie ("loss")
Log2Rat < -1 homozygotní delece
Typy sond natištěných na microarray sklíčku
BAC klony až 32 000 BAC klonů na jednom sklíčku
~ 160 kb dlouhé úseky DNA
Oligonukleotidy 25 ­ 80 párů dlouhé oligonukleotidy
mohou pokrývat i celý genom (repetitivní
sekvence jsou vynechány)
známe polohu a pořadí všech sond v lidském genomu
20
Array CGH - oligonukleotidy (NimbleGen)
Selzer RR et al. Genes Chromosomes Cancer, 2005
6-kb median
probe spacing
50- or 140-bp median
probe spacing
SNPs
SNP = single nucleotide polymorphism
jednonukleotidové variace, které jsou náhodně rozmístěny v
genomu (bodové mutace rozšířené v populaci)
nukleotidová variace, která se vyskytuje alespoň u 1% jedinců v
populaci
předpokládaný počet SNPs: 10 milionů
výskyt specifických SNP spojen s predispozicí k určitým chorobám
21
SNP Arrays ­ probe design (Affymetrix)
From Xiao Y. presentation: Exploration and Analysis of Affymetrix SNP Arrays. Center for
Bioinformatics & Molecular Biostatistics, UCSF Division of Biostatistics
SNP Arrays ­ probe design
From Xiao Y. presentation: Exploration and Analysis of Affymetrix SNP Arrays. Center for
Bioinformatics & Molecular Biostatistics, UCSF Division of Biostatistics
22
SNP arrays x expression arrays
From Xiao Y. presentation: Exploration and Analysis of Affymetrix SNP Arrays. Center for
Bioinformatics & Molecular Biostatistics, UCSF Division of Biostatistics
SNP Arrays - labeling
From Xiao Y. presentation: Exploration and Analysis of Affymetrix SNP Arrays. Center for
Bioinformatics & Molecular Biostatistics, UCSF Division of Biostatistics
23
SNP Arrays - APEX technologie
APEX = Arrayed Primer Extension
Kurg A. et al., Arrayed primer extension: solid-phase four-color DNA
resequencing and mutation detection technology. Genet Test 4:1-7, 2000.
Velké studie SNP
HapMap projekt: mezinárodní projekt, jehož cílem je identifikovat a
katalogizovat SNPs v lidské populaci a vybrat z nich ,,tag" SNPs,
kterými se skupiny lidí odlišují
SNPs, které jsou na DNA
blízko sebe se také
společně dědí a určují
haplotyp dané skupiny lidí
,,tag" SNPs odlišují dané haplotypy
24
HapMap kolekce lidské DNA 270 vzorků DNA
populace: Nigerie 30 trojic vzorků (matka, otec, dítě)
Japonsko 45 nepříbuzných vzorků
Čína 45 nepříbuzných vzorků
USA 30 trojic vzorků (matka, otec, dítě)
HapMap projekt
http://www.hapmap.org/index.html.en
The International HapMap Consortium. A second generation human haplotype map
of over 3.1 million SNPs. Nature 449, 851-861. 2007.
The International HapMap Consortium. A Haplotype Map of the Human Genome.
Nature 437, 1299-1320. 2005.
Velké studie SNP
Wellcome Trust Case control Consortium. Genome-wide association study of 14,000
cases of seven common diseases and 3,000 shared controls. Nature. 2007 Jun
7;447(7145):661-78.
3000 zdravých jedinců
2000 pacientů bipolar disorder (1 SNP)
,, coronary artery disease (1 SNP)
,, Crohn's disease (9 SNPs)
,, hypertension
,, rheumatoid arthritis (3 SNPs)
,, type 1 diabetes (1 SNP)
,, type 2 diabetes (3 SNPs)
Studovali 500 000 SNPs pomocí Affymetrix microarrays
P value < 5x10-7
25
Odchylky od referenčního genomu větší než 1kb
ještě v roce 2003 se myslelo, že většina ,,zdravých" lidí se od
referenčního genomu liší velmi nepatrně (SNPs, mikrosatelity)
array komparativní genomická hybridizace odhalila mnoho větších
oblastí DNA, které se u zdravých lidí vyskytují v různém počtu
DNA segment (většinou větší než 1 kb), který se u daného jedince
vyskytuje v jiném počtu kopií než v referenčním lidském genomu
existuje mnoho takových oblastí v genomu (řádově tisíce)
"Database of Genomic Variants"
http://projects.tcag.ca/variation/
Copy number polymorphism ­ výskyt u více než 1% jedinců dané populace
Využití HapMap kolekce ke studiu copy number variant
všichni jedinci v této kolekci byli zdraví, přesto se našlo velké množství oblastí
DNA (12% genomu), které se u těchto lidí nacházejí v různém počtu kopií
Copy number variation
26
hledání fenotypových projevů CNV (,,neškodná" genomová
varianta nebo příčina nemoci???)
CNV: pathogenic x benign x unknown clinical significance
vnášejí ,,zmatek" do experimenů, které např. hledají příčinu
vrozených genetických poruch (mentální opožděnost, vývojové
odchylky)
Copy number variation
Chromatin ImmunoPrecipitation on chip
ChIP-Chip
27
Nalezení vazebného místa
256 kb oblast 1p32 pokrytá překrývajícími se PCR produkty (~400 bp)
protilátka: trimethylace histonu H3 Lys4
Carter and Vetrie 2004 Human Mol Genet