1
Principy microarrays III
Pavla Gajdušková
Analytická cytometrie, 8. prosince 2009
Obsah přednášky
Technologie přípravy microarrays
Oblasti použití microarrays v biologii
Úvod do statistického hodnocení dat
Příklady konkrétních aplikací z literatury
2
Úvod do statistického hodnocení dat
Předpříprava dat pro statistické hodnocení
analýza obrazu (měření intenzity bodů a pozadí)
normalizace (nalezení a odstranění systematických chyb, které
nejsou způsobeny biologickým objektem)
filtrování dat (odstranění špatných bodů nebo hybridizací ze studie)
Nalezení rozdílně exprimovaných genů
výpočet zvolené statistiky a následné určení p hodnot
úprava p-hodnot
Analýza obrazu
Red Green Dapi
16-bitový obraz ve stupních šedi
hodnoty intenzity: 0 - 65 536
3
Analýza obrazu
rozdělení pixelů v nasnímaném
obraze na ty, které nesou informaci o
intenzitě bodů na sklíčku nebo
pozadí
Subarray
mnoho programů na analýzu
microarray obrazů (GenePix, Spot, ...)
výsledek: txt soubor ­ každý řádek
obsahuje informaci o jednom bodu na
sklíčku (průměrná intenzita uvnitř
bodu, intenzita okolí, variabilita mezi
pixely uvnitř bodu, ...)
Analýza obrazu
Nejdůležitější hodnota: poměr mezi intenzitami fluorescence R a G
R/G
Nejčastěji se vyjadřuje pomocí logaritmu o základu 2
M = Log2 R/G
Log2 R/G = 1
Log2 R/G =-1
ve vzorku značeném červeně je dvakrát více kopií
specifické mRNA než v zeleně značeném vzorku
ve vzorku značeném červeně je poloviční množství
kopií specifické mRNA než v zeleně značeném
vzorku
4
Analýza obrazu
Další důležitá hodnota pro kontrolu kvality hybridizace je
průměrná intenzita bodu v obou snímaných kanálech
A = (Log2R + Log2G) / 2
M = Log2 R/G
A = log2 (R/G)/2
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
M=log2R/G
-4
-2
0
2
4
0 1 2
M=log2R/G
-4
-2
0
2
4
6
Důležité předpoklady
Sondy na sklíčku jsou rozmístěny zcela náhodně
do stejné pozice na sklíčku neseskupujeme geny s podobnou funkcí;
sekvenčně příbuzné; ležící na stejném chromosomu
Hybridizace byly prováděny v náhodném pořadí
kontroly byly hybridizovány dohromady se zkoumanými vzorky
Předpokládáme, že experiment ovlivní expresi pouze malého
počtu genů v daném objektu (většina genů svoji expresi nemění)
průměr (medián) všech poměrů R/G je roven 1
průměr (medián) všech logaritmů poměrů R/G je roven 0
nestačí mít na sklíčku sondy pro geny, které nás zajímají nebo očekáváme, že
jejich exprese se bude měnit
pro normalizaci jsou nutné i další geny, jejichž exprese se nemění (těch by
měla být většina)
5
Odstranění ,,špatných" bodů
odstranění bodů: body s morfologickými abnormalitami
(problematický tisk)
s nízkou intenzitou (není exprese v
daném systemu)
s vysokým pozadím (negativní hybridizace)
Kontrolní body: prázdné body bez DNA (negativní kontrola)
,,spiked" body (pozitivní kontrola)
stejné sondy na různých místech sklíčka
Normalizace
nalezení a odstranění systematických chyb, které nejsou
způsobeny biologickým objektem
6
A = log2 (R/G)/2
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
M=log2R/G
-4
-2
0
2
4
A = log2 (R/G)/2
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
M=log2R/G
-4
-2
0
2
4
Normalizace
Není splněná podmínka, že průměr (medián)
všech logaritmů poměrů R/G je roven 0
Před normalizací: Po normalizaci:
Loess Normalizace
7
16151413
1211109
8765
4321
"Print Tip" Normalizace
Před normalizací:
Po normalizaci:
Normalizace mezi arrays
Všechny hybridizace v dané studii by měly mít podobné
rozložení hodnot kolem mediánu
"Median Absolute Deviation (MAD) Scaling"
8
Product Authors/Company/Institute
Interface/Operating
System
Reference/Features
ArrayStat 1.0 Imaging Research Inc. Windows
Software package optimised for statistical analysis of
array gene expression data. Quality control, statistical
tests of differential expression
Bioconductor
The R Project for Statistical
Computing
R-package An open source and open development software project
for the analysis and comprehension of genomic data
BRB ArrayTools
3.2.3
Molecular Statistics and
Bioinformatics Section,
Biometric Research Branch,
NCI
Excel add-in, R-
package
Wright GW et al. A random variance model for detection
of differential gene expression in samll microarray
experiments. Bioinformatics 2003 19:2448-2455.
dCHIP
Wong Lab, Harvard School
of Public Health and DanaFarber
Cancer Institute
Windows
Li C and Wong WH (2001) Model-based analysis of
oligonucleotide arrays: Expression index computation
and outlier detection, Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 98, 31-
36
Genetraffic 3.1 Iobion Informatics
Linux server,
web client
Analysing and visualizing microarray expression data.
Compliant with MIAME & MAML standard.
Lucidea Array
Spotfinder 1.0
Amersham Biosciences Windows
Fully automated image analysis software, taking into
account pen effects and calculating various quality
metrics
Lucidea Microarray
Scorecard 1.0
Amersham Biosciences Windows
Software package developed to analyse data from twocolor
experiments, calculate various quality metrics and
normalize data using an exponential method
R-package
The R Project for Statistical
Computing
R-package
One most famous statistical packages. Most libraries
including specific ones for the analysis of microarray
data.
SpotFire.net
Desktop 5.0
SpotFire Windows Asher B. Decision analytics software solutions for
proteomics analysis. J Mol Graph Model 2000 18: 79-82.
TIGR Microarray
Data Analysis
Software (MIDAS)
The Institute for Genomic
Research (TIGR)
Java tested on
Windows
2000/XP, Linux
7.2, MacOS
10.2
Saeed AI et al. TM4 : a free, open-source system for
microarray data management and analysis.
Biotechniques 2003 34:274-278
XLstat 3D Plot Addinsoft Excel add-in
Xlstat 3D Plot is a complement module for Xlstat Pro that
allows to display data in 3 dimension with an intuitive
interface.
XLstat Pro 7.1 Addinsoft Excel add-in Sotware package for statistical analysis including a wide
range of functionalities
Programy pro předpřípravu dat
http://arraysimage. free.fr/Soft.htm
Nalezení rozdílně exprimovaných genů
Array 1 Array 2 Array 3 Array 4
Gen 111
Gen 112
Gen 113
Gen 114
Gen 115 0.450.540.490.88
0.38-0.130.13-0.19
0.440.280.14
0.640.370.33-0.28
0.06-0.390.39
:
:
odstranění špatných bodů, provedena vhodná normalizace intenzit
Nulová hypotéza: medián exprese daného genu se statisticky
neliší od teoretické hodnoty mediánu (v našem případě 0)
Pro každý gen testujeme tuto hypotézu zvlášť
0.52
0.00
0.28
0.35
0.06
Medián
9
Array 1 Array 2 Array 3 Array 4
Gen 111
Gen 112
Gen 113
Gen 114
Gen 115 0.450.540.490.88
0.38-0.130.13-0.19
0.440.280.14
0.640.370.33-0.28
0.06-0.390.39
:
:
Nalezení rozdílně exprimovaných genů
0.99
p hodnota
0.02
0.38
0.25
0.78
Nulová hypotéza: medián exprese daného genu se statisticky
neliší od teoretické hodnoty mediánu (v našem případě 0)
T = ...... p hodnota pravděpodobnost s jakou lze
nulovou hypotézu zamítnout
rozdílně exprimované geny ... p hodnota < 0.01 (volitelný práh)
Statistické problémy při studiu tisíců genů
s malým počtem opakování experimentů
rozdílně exprimované geny ... p hodnota < 0.01
Příklad:
studujeme 20 000 genů na jednom sklíčku
během normalizace a kontroly kvality vyřadíme 12000 genů
testujeme 8 000 genů (pro každý vypočítáme p hodnotu)
p hodnota < 0.01 připouštíme, že 1% testovaných genů je označeno
jako rozdílně exprimované pouze náhodnou
variabilitou pokusů
8000 * 0.01 = 80 genů
korekce p hodnot s ohledem k počtu testovaných genů
použití alternativních statistik
10
From Ru-Fang Yeh presentation: Statistical Methods in Bioinformatics: Case Studies.
Center for Bioinformatics & Molecular Biostatistics, UCSF Division of Biostatistics
From Ru-Fang Yeh presentation: Statistical Methods in Bioinformatics: Case Studies.
Center for Bioinformatics & Molecular Biostatistics, UCSF Division of Biostatistics
11
Obsah přednášky
Technologie přípravy microarrays
Oblasti použití microarrays v biologii
Úvod do statistického hodnocení dat
Příklady konkrétních aplikací z literatury
Klastrování (shluková analýza) je obecná metoda, kterou je
možno použít ke spojování prvků (s podobnými vlastnostmi)
do skupin (klastrů)
Microarray analýza:
Klastrování genů (řádků) identifikace skupin genů, které mohou
být společně regulované
Klastrování vzorků (sloupců) nalezení skupin vzorků, které mají
podobné změny v expresi genů (změny na
úrovni DNA)
Klastrování
Příklad:
Sorlie et al., Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish
tumor subclasses with clinical implications. PNAS 98: 10869-10874, 2001.
12
78 karcinomů prsu (71 duktálních, 5 lobulárních a 2 in-situ)
3 fibroadenomy
4 vzorky normální tkáně prsu
Microarrays: 8 102 cDNA klonů
každý vzorek (Cy3) hybridizován s referenční RNA (Cy5)
Analýza: nalezeno 456 cDNA klonů (427 genů) s velkou
variabilitou exprese mezi různými vzorky, ale podobnou
expresí u příbuzných vzorků
Otázka: Zda existuje rozdělení karcinomů do podskupin, které
mají podobné změny v expresi genů?
Sorlie et al., PNAS 98: 10869-10874, 2001.
Design experimentu
Sorlie et al., PNAS 98: 10869-10874, 2001.
Klastrování
13
Sorlie et al., PNAS 98: 10869-10874, 2001.
Sorlie et al., PNAS 98: 10869-10874, 2001.
Rozdělení do skupin a
prognóza vývoje onemocnění
14
Programy pro analýzu microarray dat
http://arraysimage. free.fr/Soft.htm
Product Authors/Company/Institute
Interface/Operating
System
Reference/Features
ArrayStat 1.0 Imaging Research Inc.
Windows
NT/2000
Software package that is optimised for statistical analysis
of array gene expression data. Quality control, statistical
tests of differential expression
BRB ArrayTools
3.2.3
Molecular Statistics and
Bioinformatics Section,
Biometric Research Branch,
NCI
Excel add-in, R-
package
Wright GW et al. A random variance model for detection
of differential gene expression in samll microarray
experiments. Bioinformatics 2003 19:2448-2455.
Cluster
Michael Eisen's
lab;Lawrence Berkeley
National Lab (LBNL)
Windows
95/98/NT
Eisen MB et al. Cluster analysis and display of genomewide
expression patterns. Proc Natl Acad Sci USA 1998
95:14863-14868.
Cluster
Indentification Tool
(CIT)
Van Andel Research
Institute
Windows
Rhodes DR et al. CIT: identification of differentially
expressed clusters of genes from microarray data.
Bioinformatics 2002 18:205-206.
FDR controlling
procedure
(FDRalgo)
Windows
Adjusts p-values generated in multiple hypothesis testing
of gene expression data obtained by cDNA microarray
experiment.
Genesis
Bioinformatics Group,
Institute of Biomedical
Engineering, Graz
University of Technology
Java, tested on
Windows
Java suite containing various tools such as filters,
normalization, visualization tools, clustering, SOM, kmeans,
PCA, SVM, map onto chromosomal sequences.
Genetraffic 3.1 Iobion Informatics
Linux server,
web client
Analysing and visualizing microarray expression data.
Compliant with MIAME & MAML standard.
J-express
Bioinformatics research
group at the Dept. of
Informatics
Java, tested on
Windows 2000,
LINUX, Thru64
UNIX, Solaris
and Irix
Analysing gene expression data giving access to
hierarchical clustering, k-means, SOM, PCA, MDS,
profile similarity search and visualizing methods.
LACK Windows Kim C et al. Significance analysis of lexical bias in
microarray data. Bioinformatics 2003, 4:12.
Prediction Analysis
for Microarray
(PAM)
Tibshirani Lab,
Departement of Statistics,
Stanford University
Excel add-in/ R-
package
Narasimhan and Chu. Diagnosis of multiple cancer types
by shrunken centroids of gene expression; PNAS 2002
99:6567-6572.
R-package
The R Project for Statistical
Computing
R-package
One most famous statistical packages. Most libraries
including specific ones for the analysis of microarray
data.
Significance
Analysis of
Microarrays (SAM)
Tibshirani Lab,
Departement of Statistics,
Stanford University
Excel add-in/ R-
package
Tibshirani and Chu. Significance analysis of microarrays
applied to the ionizing radiation response. PNAS 2001
98: 5116-5121
SpotFire.net
Desktop 5.0
SpotFire Windows Asher B. Decision analytics software solutions for
proteomics analysis. J Mol Graph Model 2000 18: 79-82.
Veřejné databáze microarray dat
ArrayExpress
ChipDB
ExpressDB
Gene Expression Atlas
Gene Expression Database (GXD)
Gene Expression Omnibus (GEO)
GeneX
GermOnline
Human Gene Expression Index (HuGE Index)
List Of Lists Annotated (LOLA)
M-CHiPS (Multi-Conditional Hybridization Intensity Processing System)
MUSC DNA Microarray Database
NASCArrays
Oncomine
Public Expression Profiling Resource (PEPR)
READ (RIKEN cDNA Expression Array Database)
Rice Expression Database (RED)
RNA Abundance Database (RAD)
Saccharomyces Genome Database (SGD): Expression Connection
SGMD
Standford Microarray Database (SMD)
Yale Microarray Database
yeast Microarray Global Viewer (yMGV)