Mikroskopické techniky a její praktické využití Eva Bártová v Biofyzikálni ústav Akademie věd CR Brno Figure Z. Mkr&aupy Írom Ui* Iľlh to the 21 si flcntuňes (m& pa^t i 'Ji. [^ Roteit HQokß'i microscope as detaily m Jvtictůgňiptffů published n tG65 (?3). srftage reproduced «líh pi^rniisskifi of ihe Chwtes necwifcUcCuiiTiidt LHiraiy dí fyrcda; CeUcclionid Northwestern Un wratj,. USft. (5) A scherte ol Hope's mtcít&ujpc showing the ftlewru coicfronafls. Innage r^HTvhJced wiEli pei iciissksi fruin [he Moleaim FípfefiSlans MiCfúäCOpy Primer fr^-mi^scopy.isujtriuypňrncr/rTw (Ü Leka MicroEyiKails" IC5 AOE5 ccnfwol scan head, rtriHMitríiiv Mitable from í a 02 i\v^w.lefca-m*24 Gray Levels [u>r>Aiiftjr. KSrtgej Fia 1\ Rit el tilth and nrpu leirels in flraital imaaei Počet pixeJů kamery závisí na použitém CCD chipu a na technologii vytvoření obrazu. í mikroskopie Polský prof. Alexander Jablonski vysvětlil, jak jsou elektrony v fluor of or ech excitovány ze základního stavu do stavu energeticky vyššího a jak mohou tyto excitované elektrony emisi fotonů relaxovat nebo jinými mechanismy se nakonec vrátit zpět na základni hladinu. Fluorescence je statisticky pravděpodobnější než fosforescence, doba existence fluorescenčního stavu je velmi krátká (1 x 10-5 to 10-8 s), zatímco f os foresee n ce je poněkud delší (1 x 104 s až minuty nebo hodiny) electronic ground state FLUORO OMY: 3 skupiny 1. fluorochromy nesoucí další molekulu, která je cílená na určitou strukturu (protilátky, lektiny......a tzv. quantum dots) 2. základní jejich vlastností je vazebná schopnost na nějakou strukturu (DAPI) nebo se mění jejich fluorescence, s měnícím se množstvím navázané molekuly 3. fluorochromy produkované samotnými organismy (GFP) -znázorňování živých buněk, vývojové studie a vůbec použití v molekulární biologii Fhjofťphoir tot Blut AleaFluůrJ AMCA Aequorii HoachstaaSft ACMAUV Hotchritttt rOfi GFPWiHvpeWcrUVet GFPWildVpeWs. AlesFluDr*6 ClO* FluoBWiftlfflC/PIAF) FlüüPoJöd*» Luriferyefan JC-1 FluoioíddUVdicHyítibafTidii^ AlmFlto«» Eofln aIbqfi.,:-::: CyJJ Aleca Fluorid AIbqFI.ij£::J. ■mnc I'. I-k* r *■ v" -■ R-plycDer/li nn Rhodamine A lea Flu: z:->: Tecaete-i AliraFlwW* P D pH í fflflntt J. Ffl Ethidiu mftrwTiJa Feu tjen (ftwrarandinej AcidRjdis» AleaFluoFÉ33 AleaFluarW PBCjŕocujwíte AlecaFluoPVbTj AlraaFluoPB£0 PBC>ÍGanii^rtes Cv7 tu Infrared Aequorea victoria Fenomén fluorescence první pozoroval Sir George Gabriel Stokes roku 1852 Jev byl fyzikálně popsán Alexanderem Jablonskim roku 1935 Počet užívaných fluorochromů se uzavřel v 90.letech 20. stol. Shimomura izoloval v roce 1962 z medúzy Aequorea victoria žijící v Tichém oceánu green flourescent protein - GFP Faktory ovlivňující citlivost fluorescence 1. Intenzita zdroje Účinnost optického systému Štěrbiny monochromátoru Citlivost detektoru k vzorek sám o sobě obsahuje fluorescenční molekuly (auto-fluorescence) nutno fluorochrom ke vzorku přidat v závislosti na cílech pozorování Principle of confocal microscopy Lase* Confocal P inh o l*s á^j Object in FocjI Plane noun Focal Plane Kontrolovaná hloubka pole Eliminace degradace obrazu mimo ohnisko pomocí prostorové filtrace Eliminace Airy disc pattern Série optických ŕezú o definované tloušťce Vysoká kvalita obrazu Stage scanning Beam sc aiming Nipkow disck scanning LSCM Fig. 4: Intensity profiles of the Airy disk patterns of one specimen detail and of two details at different distances. Ficj.5: Airy disk patterns of different size as an example for the resolving power of low NA tieft} and high IIA iricjlitj objectives. Pod rozlišovací schopností mikroskopu se chápe minimální vzdálenost dvou bodů objektu, které se ještě zobrazí jako navzájem oddělené. Žádný objektiv nemůže zobrazit bodový objekt opět jako bod. I při dokonalé korekci všech možných vad zobrazení, které souvisí s technologií výroby objektivů, jsou obrazem bodu Airyho kroužky. Tak se nazývá difrakční obrazec vznikající ohybem zobrazujícího se světla na čočkách objektivu. Při zobrazení dvou blízkých bodů se mohou jejich Airyho kroužky překrývat, až se při jisté minimální vzdálenosti stanou téměř nerozlišitelnými. Tato mez se běžné odhaduje dle Rayleighova kritéria (1879), které v podstatě vychází ze skutečnosti, že lidský zrak zaznamená pozvolný předěl mezi dvěma difrakčními kroužky teprve tehdy, poklesne-li intenzita mezi nimi alespoň o 20 % oproti přilehlým maximům. Pro modré světlo (viditelné záření nejkratších vlnových délek) se teoretická rozlišovací schopnost blíží hodnotě kolem 0,17 m. Praktická rozlišovací schopnost reálných objektivů závisí ovšem také na tom, jak dokonale se při výrobe podaří zkorigovat různé vady zobrazení. Princip fluorescenčního mikroskopu Excitační filtr, (nastaven na modrou tj. 450-490 nm ) . Okular n Bariérový filtr, (nastaven na zelenou tj. 520-560 nm ) Dichroické zrcadlo, odráží světlo pod 510 nm a propouští nad 510 nm LSCM mikroskop laser pinhole detektor *£ % Tandem scanning microscopes based on Nipkow disk Source of light pinholes in the disk 1 1 Dichroic mirror ^^ä^ 1 J______. i i ^ CCD ^^b! 1 *| | 1 o rotation Sample Flg. 3; Via deconvolution. artefacts tan be computed out of íl u ore sc e n te images, a). The s* artefacts are «used by the stray lig lit from non-foaiseit areas above and beiow the f ecus leveL These phenomena, referred to as convolution, res u ft in glare, distortion and hlurrlness. b). De convolution is a recognised mathematical procedure for eliminating such artefacts. The resulting Image displayed Is sh^rpei with less noise and tints at higher resolution. This Is also advantageous Tor more extensive analyses. KONVOLUCE - artefakty obrázku - nezaostřená místa pod nebo nad rovinou zobrazení (u flourescenční mikroskopie nebo u histologických řezů - záře, deformace obrazu, zastření). - omezuje přesnost a rychlost analýzy obrazu DEKONVOLUCE - matematická metoda sloužící k eliminaci artefaktů obrázku - výsledný obrázek má méně šumu a větší rozlišení Mikroskopovna Coolsnap CCD Control unit to AOTF temperature T* lnová 70 Spectrum Luxmeter ^Compressed air ■■ L DC 12 V for Peltier element 25 am fiber Ar/Kr Laser Innova 70 (Coherent) Laser head Rear view on the laser K^KSíjJ^Hi • •••** f ;| i _IIÜft_J 1 CI I;* i • r T, |(J «^ • * * » í é * í * t < í t * Internal aperture Light open/closed Screws adjusting rear mirror ^^^^m SC35/c-mvcJ 3D-projection ' ■ m ■ T ** řť#, u> fO X GFP-HPl ß Co je to FRAP? FRAP (Fluorescence Recovery after PhotobleachincO - návrat fluorescence v definované oblasti vzorku po vysvícení 'bleaching procesu'. výsledkem je pohyb nevysvícených fluoroforú z okolních míst vysvícené oblasti - je využíván k měření dynamiky 2D nebo 3D mobility molekul, např. difuse, transport nebo další typy pohybů fluorescenčně značených molekul membrán nebo živých buněk^^ ###### p re-bleach c bleach +3* ■6e ■ 9s +12» HP1a ťii I tt- ).G- * heterochnůrnatír» -A» eucftromatiri 0- niiiiiiimiuiimiii i n imimnm uni MMIMTIIMIIM MMHIII rrmrl O CO h- o> s o f n n ^ io F>>-IOffiT- T" T— T- TT-r Time of Recovery (s) 0 HP1p li ■ ii rii i ii-i Pil 1 1 II Pil J PI TTTTTTTTTTTTTTTTTTTI ^- heterochromalin -A- eüctirornalln .....J Ml 1......1 M 1 PII II .....| o co r^ o& en OOlffiCDyjODCOQ^jýpj^ oi rf ^r iri r> d oi Time of Recovery (s) Time of Recovery (s) JUS K?ŕESiäK35Qo8,,~,~ Time of Recovery (e) Inkubační komůrky pro přímý mikroskop I - cells can be grown on both upper and lower sides of the chamber; this m part is filled fully with medium I - medium reaches / under the glass tubes; cells are not grown here ü Partition with opening on the bottom of the chamber (for experiments under upright microscope) Cover glass 24x50 mm Termistors in short tubes on the side of the chamber Glass tubes bent under the upper glass (to enable C02 to flow above medium in the part II of the chamber) GFP in žebr afis h (Danio r erio) wwiy.ifom-ieo-cainims.it/ľesearch/mioiie.pliD Förster Resonance Energy Transfer Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) studium interakcí proteinů nebo blízkých molekul • popisuje mechanismus přenosu energie mezi dvěma fluorescenčními molekulami • fluorescenční donor je excitován svojí specifickou fluorescencí o excitační vlnové délce • dalekonosným dipol-dipole vazebným mechanismem nezářivým přenosem excitována druhá molekula - akceptor • donor se vrací do elektronově základního stavu • popsaný mechanismus přenosu energie je nazýván "Förster resonance energy transfer" (FRET), pojmenováno podle německého vědce Theodora Förstera. Pokud jsou obě molekuly fluoresceční, je často užíván název "fluorescence resonance energy transfer", ačkoliv energie není W- 85032154 Fluoresence In Situ Hybridization Labeling with iiuorescent dye renalure Hybridize '/ httpitfwww.acoesBexDellence .org/R CľVUGG/fisli.hílml 3D-FISH a konfokalni mikroskopie ■ í 1 i l i * l | v * Galerie optických řezů Maximální obraz Všech řezů 3D reconstrukce CT Weierich et al., (2003) in press Segmentace FISH signálu R6 G6 RIO G 10 R7 G7 RH G 11 R8 G8 R max G max Automatická analýza obrazu FISH 2.0 (Zeiss+MicroMax) (Mar 21 2001] File Video Mode Edit Filter Segment Nucleus Manual segmentation 3D-View -Inlxi SčŠJXY projection SíáROOO G:000 B:000 X:354 Y:29 R:000 G:000 B:000 X:136 Y:39 Comparative genome hybridization Xdet 4pl5..Vpl6 del 20 amp lpdel amp 3q26.3 «27 ■ del \i\21 «(KT, del Uql2-ql4 amp 3pl2~p21 dri 9ql3-q22 del CGH on metaphase spreads Tumor DNA rmalDNA + Cot1 DNA ■ 1 ■■■■ ■■■■ 11.1 -111 lil chromosomal DNA . 1 1 m j_*^^^^ľ^^^^^TM*K-J^^^i^^^i^ľ^^^^^^^^_^^^^^^^^J P"^^ £ ii 1 c HED Pro uspokojivé fluorescenční zobrazení je nezbytné splnění třech na sobě nezávislých kritérií Sensitivity (signa-to-noise ratio) The Imaging triangle' Spatial resolution Acquisition speed (temporal resolution) ELEKTRONOVOVY MIKROSKOP Transmisní nebo rastrovací (skenovací) Na každé místo vzorku je zaměřen úzký paprsek elektronu (prochází jej po řádcích - odtud řádkovací). idaiících elektronů s materiálem vzorku vznikají různě detekovatelné složky. Jak paprsek putuje po vzorku, mění se podle charakteru povrchu úroveň signálu v detektoru. Z těchto signálů je pak sestavován výsledný obraz. Získaný obraz je standardně monochromatický. Zdrojem elektronů je ele J