Mikroreliéfová metoda metoda studia povrchu neprůhledných objektů Možnosti studia povrchu neprůhledných objektů • mikroskopie v dopadajícím „osvětlení“ – optická (např. mikroskop Lug Zeiss) – elektronová – SEM, kryo SEM (aquaSEM) • izolace povrchové vrstvy • zhotovení otisku mikroreliéfu • konfokální mikroskopie Lug Zeiss Jena Mikroskop pro práci v dopadajícím světle speciální konstrukce objektivu, který štěrbinou ve vnějším plášti osvětluje objekt shora časté využití při studiu epidermis a průduchů Terminologie průduchů • průduch (stoma, pl. stomata) – zajišťují výměnu plynů (CO2, O2) mezi ovzduším a mezofylem listu a výdej vodní páry z listu do ovzduší • je tvořen 2 svěracími buňkami, nejčastěji ledvinovitého tvaru, které ohraničují pór, jehož velikost je aktivně regulována • změny tvaru svěracích buněk jsou ovlivňovány turgorem • stomatální komplex = průduch + okolní epidermální buňky • buňka sousední (Neighbour Cell) – epidermální buňka v kontaktu s průduchem nebo jeho prekurzorem morfologicky stejná jako ostatní epidermální buňky • buňka vedlejší (Subsidiary Cell) – epidermální buňka v kontaktu s průduchem nebo jeho prekurzorem, morfologicky odlišná od ostatních epidermálních buněk Tvar a rozmístění průduchů děloha Arabidopsis thaliana Heynh. Transmission electron micrograph Zhao and Sack (1999) Bar = 2 µm Cryo-scanning electron micrograph of maturing epidermis from a cotyledon. The larger, non-stomatal cells are pavement cells that are shaped like pieces of a jigsaw puzzle. Bar = 30 µmNadeau J.A. and Sack F.D. The Arabidopsis Book, 2002 Tvar a rozmístění průduchů květní orgány Arabidopsis thaliana Heynh. Cryo-scanning electron micrograph – modifikovaná stomata (hydatody) na vrcholu nektarií Cryo-scanning electron micrograph - stomata na abaxiální epidermis prašníku Anther micrograph from Kim Findlay. Bars = 30 µm (top) and 100 µm (bottom). Nadeau J.A. and Sack F.D. The Arabidopsis Book, 2002 Listy podle umístění průduchů • hypostomatické – stomata většinou (až 90%) na spodní straně listu, ve svrchní epidermis mohou zcela chybět = nejčastější typ • amfistomatické – stomata na obou stranách listu ve srovnatelném počtu (Iris, trávy) • epistomatické – stomata pouze na svrchní straně listu (vzplývavé listy vodních rostlin, některé trávy – Festuca, Melica, Brachypodium) Stomata podle umístění na listech • stomata faneroporní – svěrací buňky a epidermis leží v jedné rovině = nejčastější případ • stomata emerzní – vyčnívají nad úroveň epidermis – hygrofyty, plovoucí listy vodních rostlin • stomata submerzní – ponořená stomata – xerofyty (Iris, Chlorophytum, Pinus, Nerium oleander) Iris amfistomatický list, stomata submerzní Nerium oleander hypostomatický list, stomata submerzní v dutině s trichomy Typy stomat podle anatomie a mechaniky typ Amaryllis břišní stěna svěracích buněk je vyztužená, nepružná, vnější zůstává pružná časté u jednoděložných rostlin typ Helleborus břišní stěna svěracích buněk je nerovnoměrně ztlustlá, vnější zůstává pružná dvouděložné i některé jednoděložné Pteridofytní typ hřbetní stěna svěracích buněk je silná, lumen buněk se mění z oválu na kruh kapradiny Typ Graminae svěrací buňky tvaru piškotů + vedlejší buňky trávy, ostřice, sítiny, akácie Gymnospermní typ svěrací buňky ponořené, silnostěnné, malá možnost pohybu, na zimu se zavírají voskem jehličnany Klasifikace stomat podle počtu a uspořádání obklopujících buněk • stomata izocytická – epidermální buňky se neliší od buněk epidermis (vývoj haplocheilický) – anomocytická – anomotetracytická (Chlorophytum, Iris) • stomata anizocytická – vývoj syndetocheilický – diferencované sousední buňky různě uspořádané: – paracytická (Magnolia, Cyperus) – brachyparatetracytická (Tradescantia) – polocytická (Dryopteric, Nephrolepis) – amfianizocytická (Begonia) Tvar a rozmístění a vývoj průduchů adaxiální strana dělohy tabáku Nicotiana tabacum L. Stomatální densita: (hustota průduchů) = počet průduchů na jednotku plochy Stomatální index: počet průduchů dělený celkovým počtem epidermálních buněk včetně stomat. zralý průduch mladý průduch mateřská buňka průduchu Geisler et al. (2000) Syndetocheilický vývoj průduchů Abaxiální strana dělohy Arabidopsis sledování pomocí otisku v laku na nehty Bar = 25 µm Diagram hlavních buněčných typů a dělení ve vývoji průduchů u Arabidopsis Nadeau J.A. and Sack F.D. The Arabidopsis Book, 2002 mateřská buňka průduchu Konfokální snímek abaxiální epidermis listu Arabidopsis 20 µm Cutler et al. 2000 vizualizace buněčných stěn = GFP lokalizovaný v plazmatické membráně (“Q8”) Definice rozlišovací schopnosti λ λ a = = A n . sin α λ - vlnová délka světla A – numerická apertura n – index lomu α – polovina otvorového úhlu (otvorový úhel lze zvětšit pomocí šikmého osvětlení) Vliv šikmého osvětlení na rozlišovací schopnost Možnosti nastavení šikmého osvětlení • zešikmením zrcátka (používáme plochou stranu zrcátka) • vložením stínícího disku s excentricky umístěným otvorem • vysunutí aperturní clony mimo optickou osu • vysunutí kondenzoru mimo optickou osu