FluorescenFluorescenčční mikroskopiení mikroskopie principy a použitíprincipy a použití • objekt absorbuje záření určité vlnové délky, které se vnitroatomovým přeskupením změní na záření o delší vlnové délce • excitace – viditelné světlo, UV, x, α, β, γ LuminiscenceLuminiscence Stokesův zákon: λE < λF Emitované záření má větší vlnovou délku a tudíž nižší energii. E = h . c/λ Stokesův posuv λ Rozdíl vlnových délek absorpčního (excitačního) a emisního maxima excitace světlem:excitace světlem: • fosforescencefosforescence – vyzařování světla trvá i po přerušení excitace • fluorescencefluorescence – nemá setrvačnost, záření zaniká po přerušení excitace excitace vyvolexcitace vyvolaannáá chemickou reakcíchemickou reakcí:: • chemiluminiscence LuminiscenceLuminiscence Detekce fluorescenceDetekce fluorescence • spektrofluorometry a „microplate readers“ měří průměr vlastností vzorků (µl až ml). • fluorescenční mikroskopy rozlišují fluorescenci ve dvou nebo třech rozměrech pro mikroskopické objekty (v průměru menší než ~ 0.1 mm). • fluorescenční scannery („microarray readers“) rozlišují fluorescenci ve dvou rozměrech pro makroskopické objekty jako jsou elektroforetické gely, bloty a chromatogramy. • průtokové cytometry (Flow cytometers) měří fluorescenci každé buňky v protékajícím proudu, což umožňuje identifikovat a kvantifikovat subpopulace buněk ve velkém vzorku. • konfokální mikroskopie Princip fluorescenčního mikroskopuPrincip fluorescenčního mikroskopu excitační (budící) filtr závěrný (bariérový) filtr vzorek Excitační filtry - OlympusExcitační filtry - Olympus 500 nm % T λ Bariérové filtry - OlympusBariérové filtry - Olympus 500 nm Transmisní fluorescenční mikroskopTransmisní fluorescenční mikroskop Dichroické zrcadlo a princip funkceDichroické zrcadlo a princip funkce Epifluorescenční mikroskop - OlympusEpifluorescenční mikroskop - Olympus Olympus BX-51 - epifluoescence „„Kostky“ = kombinace filtrů a dichroickéhoKostky“ = kombinace filtrů a dichroického zrcadla pro epifluorescencizrcadla pro epifluorescenci Typy fluorescenceTypy fluorescence autofluorescence barvení fluorochromy fluorochromem značené protilátky indukovaná fluorescence sekundární fluorescence imunofluorescence = primární fluorescence Srovnání fluorescenčních barvivSrovnání fluorescenčních barviv 351 nm UVA 488 nm 568 nm 648 nm • primární (autofluorescence)primární (autofluorescence) – častá u rostlinných pletiv • chlorofyl • lignin, suberin • pryskyřice, sekundární metabolity FluorescenceFluorescence • sekundárnísekundární – fluorochromy – specifická vazba na určité struktury (DNA - DAPI, Hoechst 33258) • fluorescenční imunohistochemiefluorescenční imunohistochemie – spojuje sekundární fluorescenci s reakcí: antigen x protilátka (detekce určitých proteinů) • fluorescenční in situ hybridizacefluorescenční in situ hybridizace – detekce určitých sekvencí– detekce určitých sekvencí vysoká specificita a citlivost • značení GMOznačení GMO fluoreskujícími proteiny (GFP,YFP) AutofluorescenceAutofluorescence příčný řez kořenem trávy Cynodon dactylon A. Lux Autofluorescence ligninuAutofluorescence ligninu v xylému a sklerenchymuv xylému a sklerenchymu snímek příčného řezu cévním svazkem foto-soutěž Nikon, 2004 UV excitace Kalóza v pylových láčkáchKalóza v pylových láčkách fluorochrom: anilínová modř UV excitace pylová zrna pylové láčky Fluorescenční barvivaFluorescenční barviva fluorescein a rhodaminfluorescein a rhodamin fluorescein emituje intenzivní zelenou fluorescenci po excitaci modrým světlem rhodamin emituje červenou fluorescenci po excitaci zelenožlutým světlem Různé složky buněk mohou být barveny oběma barvivy současně KombinaceKombinace fluorochromůfluorochromů a filtrůa filtrů FITC barví se mikrotubuly propidium jodid barví jádra kombinovaný obraz – simultánní emise kultura buněk A549 Kombinace fluorochromů a filtrůKombinace fluorochromů a filtrů DAPI + FITC Řez řapíkem listuŘez řapíkem listu Stonek jedle v modrofialovém světleStonek jedle v modrofialovém světle fluorochrom: akridinová oranž Sledování životaschopnosti buněkSledování životaschopnosti buněk kalus mrkvekalus mrkve FDA substrát: FDA esterázy fluorescein + acetát SledováníSledování vývojevývoje kalusu mrkvekalusu mrkve BF - DIC DAPI Kombinace DAPI aKombinace DAPI a fázového kontrastufázového kontrastu DAPI fázový kontrast kombinovaný obraz Historie GFPHistorie GFP http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/shimomura.html fotoreceptory na okraji klobouku medůzy Osamu Shimomura (1962) 1955 první popis luminiscence medůzy 2008 Nobelova cena za chemii Modifikace GFPModifikace GFP Roger Tsien La Jola, Kalifornie   http://www.tsienlab.ucsd.edu/People.htm GFPGFP http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/GFP/GFPbackgrnd.html „jellyfish“ Victoria aequorea GFP in cultured tobacco cells, confocal image PtK1 cell with antibody staining forPtK1 cell with antibody staining for microtubules (green) and DNA (blue)microtubules (green) and DNA (blue) (A. Khodjakov, Ph.D.,Wadsworth LabsAlbany, NY)(A. Khodjakov, Ph.D.,Wadsworth LabsAlbany, NY) originální snímek http://www.aqi.com/index.php snímek po úpravě Arabidopsis DR5::GFP Auxin Reporter využití GFP pro sledování auxinu embryokořen kořen + auxin DR5rev 35S min GFP 35S pA J. Friml auxinem aktivovatelný promotor + DAPI Příklady tříbarevné fluorescence Courtesy Leica Microsystems Imaging Solutions, Ltd., UK. Bovine Endothelial CellBovine Endothelial CellCell infected with poxvirusCell infected with poxvirus (630x)(630x) Honorable Mention, 2007 Nicon Competition Dr. Daniel Kalman Fotostabilita OG514 Oregon Green 514 phalloidin fluorescein phalloidin 1s 10s 20s 30s ChemiluminiscenceChemiluminiscence Excitace elektronů je vyvolána chemickou reakcí Při deexcitaci dochází k vyzáření světla Bioluminiscence světluška Noctiluca scintillans ATP + luciferin + O2 AMP + PPi + CO2 + H2O + oxyluciferin + světlo luciferáza Mg 2+ Využití chemiluminiscenceVyužití chemiluminiscence • Stanovení NO NO + O3 → NO2 * + O2 NO2 * → NO2 + světlo • Stanovení H2O2 Luminol + H2O2 3-aminoftalát + světlo peroxidáza Transformované rostlinky kasavy zTransformované rostlinky kasavy z embryogenní kulturyembryogenní kultury rostlinky vizualizace aktivity luciferázy: postříkáno luciferinem – světelná emise měřena luminometrem signální gen = luciferáza Zajímavé adresy • http://www.bioscience.org/lecture/molbiol/micro/frame.htm# s0076.htm • http://dept.kent.edu/projects/cell/index.htm • http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/ fluorhome.html • http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/PlantAnatomy/index. html • http://www.aqi.com/index.php • http://www.probes.com/handbook/ Honorable Mention, 2007 Nikon Competition Carmen Laethem Aerie Pharmaceuticals Research Triangle Park, North Carolina, USA Primary porcine trabecular meshwork cells (20x)