Fyziologie buněčných systémů (praktické aplikace) A. Kozubík Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i., (Oddělenícytokinetiky) Ústav experimentální biologie, PřF MU (Oddělení fyziologie a imunologie živočich ) Brno MEMBRÁNOVÉ POSFOLIPIDY CYCLOOXYGE NAZY TXA2 TXB2 PGG2 PGH2 PGI2 PGD2 PGE2 I PLA2 f=\/=\ ^\ / COOH v=A= EPOXYGENÁZY (P450) I EPOXYKYSELINY, DIOLY, atd. _^C5Hii O PGE2: LTC4: COOH OH OH LIPOXYGENÁZY I LTA4 OH LTB4 COOH S CH2 CH CO NH CH2 COOH NH COCH2CH2CHCOOH NH2 LTC4 LTD4 LTE4 LTF4 Metabolická přeměna kyseliny arachidonové: Některé možnosti modulace i MEMBRÁNOVÉ POSFOLIPIDY I INDOMETHACIN DICLOPHENAC cyclooxygenazy f PROSTAGLANDINY THROMBOXANY PROSTACYCLINY KYSELINA ARACHIDONOVÁ SKF525A, 9-HE Y T l Zkratky: ETYA = 5,8,11,14 -eicosatetraynoic acid ESC = esculetin NDGA = nordihydroguaiaretic acid FLAP = 5-lipoxygenase activating protein 9-HE = 9-hydroxyellipticin HETEs = hydroxyeicosatetraenoic acids HPETEs = hydroperoxyeicosatetraenoic acids EETs = epoxyeicosatrienoic acids SKF525A = proadifen 12-lipoxygenaza 5-lipoxygenaza LEUKOTRIENY EETs HETEs , DIOLS ^15-lipoxygenaza; 3 l'i:>M.ii;l.inHiíis (I'G) Epoxyd «warnen ok acids [ELT) \ \\\\toy.\\ JL'L>s.L[LTraLLn«ii: acids (HETE; Leukotrien« (LT) Hcpoxili™ (HX) Upoňw (LXJ Hydrci)C)'iicosÄKirsinoic acids [HE']"E) HydruA>TÍHJsa[etracrn>ie acids (HETEJ BIOLOGICAL MEDIATORS Fosfolipidový metabolismus a působení ionizujícího záření (škodlivých faktorů životního prostředí) THE ARACHIDONIC ACID CASCADE o ™1 Arachidonic Acid 4ť (5 Cyclooxygenase o A--N=^s^s COOH OH OH Prostaglandins Thromboxane Prostacyclin ♦ Lipoxms (A & B) Hydroxy Fatty acids (HETEs. HPETEs) Leukotriene B4 (EIKOSANOIDY) i^vVyv\CooH V-\on Leukotriene C4 —► LTD4 —► LTE4 Zánět, karcinogeneze 4 Dobový kontext od 40.- 80. léta 20. stol. Radiobilogický výzkum především pro vojenské účely. Důsledky: Utlumení a poškození krvetvorby (intenzívně proliferujících populací) imunitních funkcí a celého organismu. Vznik nádorů včetně leukémií atd. ,smrt. (Nevada, USA) ^ Jestliže dojde k celotělovému vystavení ionizujícímu záření, dochází k rozvoji tzv. RADIAČNÍHO SYNDROMU provázeného devastujícími účinky na organismus The early acting growth factor which maximises host defense loid Stem Myeloid Stem Cell GM-CSF IL-3 CFU-GEMM GM-CSF [GM IL-3 BFU-E CFU-Meg GM-CSF IL-3 GM-CSF IL-3 CFU-G CFU-M GM-CSF G-CSF CFU-Eo GM-CSF M-CSF GM CSF IL-5 <ä <® m # <# CFU-E EPO Megakaryoblast I Myeloblast Monoblast GM-CSF IL-3 GM-CSF G-CSF Myeloblast GM-CSF M-CSF m m I GM-CSF IL-5 Proerythroblast Erythrocyte Megakaryocyte Platelets Neutrophilic Myelocyte I GM-CSF ,C-CSF Promonocyte R Polymorpho- nucleated Neutrophil i Uonocy I GM JM-C GM-CSF M-CSF Monocyte I GM-CSF -CSF Eosinophilic Myelocyte IGM-CSF llL-5 Eosinophil Macrophage Bas IL-3 / IL-4 Myeloblast IL-3/IL-4 Mast Ce.i Formy nemoci z ozáření (myš) Průběh nemoci závisí zejména na 1) dávce ozáření 2) na druhu a celkové „kondici" organismu. Forma nemoci z ozáření Dávka Hlavní oblasti postižení Dřeňová (má smysl 1) 0.1-6 Gy Kmenové buňky K.D. Střevní 5 -10 Gy Epitely, zejména střeva Centrálně nervová 100 Gy viz výše včetně C.N.S. zvládnutí této formy rozhoduje o přežití organismu Pozitiva: 1) výsledky uplatnitelné v radioterapii nádorů 2) objev kmenové buňky krvetvorby 3) radiací utlumená krvetvorba - model pro studium reg. schopností savčího org. cas S tresor (ť) poškození navozující podnět Reakce protektivní terapeutický „režim ovlivnění" - (možnosti modulace) Experimental Hematology 21:138-142 (1993) © 1993 International Society for Experimental Hematology Experimental Hematology The effect of nordihydroguaiaretic acid, an inhibitor of prostaglandin and leukotriene It biosynthesis, on hematopoiesis of gamma-irradiated mice Alois Kozubík, Jiřina Hofmanová, Jiřina Holá, Jaromíra Netiková o o ^ m ö ö o ö ö C NDGA(mg) Fig. 1. Numbers of endogenous macroscopic spleen colonies (KCHnjracejrradiat«i^M inTecr!on^rTSou^ose^TOT^c^^^Tig^5r^Hr^^TOr respective groups comprised 20 to 30 animals. * p<0.05, ** p<0.01 as compared with control (C) mice NDGA(mg) Fig. 2. Dynamics of the postirradiation recovery of GM-CFC in mice irradiated with a dose of 5 Gy 1 hour after i.p. injection of various doses (0.015 to 0.3 mg) of NDGA. * p<0.05, ** p<0.01 as compared with control (C) mice Efekty aplikace NDGA „v protektivním režimu" a její dávkově závislé účinky na regeneraci ESC a GM-CFC (v čase). Indices Non-irrad. control Exp. group Days after irradiation 5 10 14 21 Granulocytes 595.8±52.9 C NDGA 406.4±51.8 717.7*+64.0 ^ 971.5+130.8 601.1+82.2 ^ 1597.8±176.0*^ 575.7±37.5 1300.4+131.2 1486.4±187.9 Lymphocytes 3184.2+239.4 C NDGA 787.5±81.8 935.9±83.5 830.8±140.0 1575.2±141.6 1025.9+113.0 1617.6±105.5 1831.6±244.9 2121.3±268.1 Nucleated cells per femur x 10?3.0141±0.1476 C NDGA 0.8240+0.0942 0.7577±0.0417 1.5486±0.0657 1.825S±0.0778 a 1.6477+0.440 2.2960+0.1500* T 2.4760±0.0721 3.4919+0.2023** Numbers of granulocytes and lymphocytes, and bone marrow cellularity measured at selected postirradiational intervals in control (C) and experimental mice treated with NDGA at a dose of 0.3 mg per mouse 1 hour before 5 Gy gamma-irradiation. At least 10 animals per group were used. *p<0.05; **p<0.01 as compared with control (C) mice Fig. 3. Endogenous spleen colony numbers (ESC) detected on day 10 (A), GM-CFC numbers in femoral marrow on day 2 (B) and exogenous spleen colony numbers (CFU-S) in femoral marrow on days 2 and 6 (C) after 5 Gy of gamma-irradiation and experimental treatment (0.3 mg of NDGA, 0.25 mg INDO or 0.51 mg ESCUL, i.e., isomolar doses administered 1 hour before irradiation). Ten mice per group were used for ESC and CFU-S determination; each value for GM-CFC represents the average of 3 independent experiments. * p<0.05; ** p<0.01 *** p<0.001 as compared with control (C) mice ESC(a) GM-CFC (b) PER FEMUR-102 CFU-S (c PER FEMUR-102 30 25- 20 15- 10 0J P<0.05 j ** In ZD LJ l/l < O I O Q 35 30 2.5 i 20 1 5 1 0 05 0 y 30- 25- 20 1 5 1.0- 05- 0J P<0.05 V/ 1 É >-< a => n O y S a co a Periferní krev Efekty dalších inhibitorů Kostní dřeň 200 on LU >- CD >3 — _ o V 1-1— >- CD CD O CD 150 100- 50- 0J r~r 01 T 10 15 DAYS AFTER IRRADIATION —i 21 Figure 3. Percentage changes (related to 100% of irradiated control) of peripheral blood granulocytes (#. O) and lymphocytes (J,D) in selected intervals after 5-Gy irradiation of mice. One hour before irradiation, mice were injected i.p. with indomethncin (0-3 mg/mousc, closed symbols) or esculetin (U-l.1) mg/mousc, open symbols). Control micr^vcTeTTTjccted with the vehicle. Ten mice from two independent experiments per point were used (mcan + SEM). Statistical significance: x, p<0-05; and xx, /><0-01 as compared with control. Inhibitory cyklooxygenáz (INDO) stimuluj? (+) a llipoxygenáz (ESUL) inhibuii (-) granulopoézu lymfopoézu INT. J. RADIAT. 3IOL., 19941 VOL. 65, NO. 3, 369-377 Effects of drugs inhibiting prostaglandin or leukotriene biosynthesis on postirradiation haematopoiesis in mouse A. KOZUBÍK*, j. HOFMANOVÁ, M. POSPÍŠIL, J. NETÍKOVA, j. HOLÁ and A. LOJEK (Rttiivrd 21 Maj 1993; ituutil 31 Aug**! W3; mcipttd 13 October 1SS3> i Cxĺ 400 300 2j 200 : 0J 400 t-300 en r200 en r100 Š L0 £z —1 £= id cd ^ «-J Q cd tn =ž CD CD i_l IS) CD Figure 2. Mean ± SEM numbers of CFU-S and GM-CFC in the femoral bone marrow of the 8-5 Gy-irradiated and bone marrow-transplanted mouse determined on day 6 after transplantation. On days 3, 4 and 5 after transplantation mice were ~injected with indomethacin (IiNDO, 0025 mg/mouse and dose) or esculetin (ESCUL, U-U12S mg/rriouse arid dose), bl tWo daily doses (a total of six injections were administered). Control mice (open columns and dotted areas) were treated in the same way with the vehicle. Two independent experiments were performed and the data were pooled. Twelve mice per group were used. Statistical significance: x, /><005; and xx, /><0-01 as compared with controls. Příklad aplikace inhibitorů metabolismu AA v „terapeutickém režimu" NSAIDs lze tedy použít jak k prevenci, tak při úpravě poškození INT. T. RADIAT. BIOL., 1904. VOL. S5. NO. 3, 369-37? Effects of drugs inhibiting prostaglandin or ieukotriene biosynthesis on postirradiation haematopoiesis in mouse A. KOZUBÍK*, j. HOFMANOVÁ, M. POSPÍŠIL, J. NETIKOVÁ, J. HOLÁ and A. LOJEK f Riaiecl 21 Mv 1<&3; nnW 31 J.jutI ISS3; uap\,i if Qcfefcr 1993, 1-1--1-1---1 0 12 3 4 RADIATION DOSE(Gy) RADIATION DOSE (Gy) Figure 4. Radiation survival curves of femoral marrow CFU-S (a) or GM-CFC (b) populations. Control mice were injected i.p. with the vehicle (□, dotted lines). Experimental animals were treated with indomethacin {0-3 mg/mouse; •—thick lines) or esculctin (0-15mg/mouse; O- thin lines) lh before irradiation with the indicated doses. Bone marrow for transplantation (CFU-S) or determination of GM-CFC was taken 1 h after irradiation. Results represent pooled data from two independent experiments (mean + SEM). Eight to twelve mice per point were used. INT. J. RADIAT. HIOL., 1994, VOL. 65, NO. 3, 369-377 Effects of drugs inhibiting prostaglandin or leukotriene biosynthesis on postirradiation haematopoiesis in mouse A. KOZUBÍK*, J. HOFMANOVÁ, M, POSPÍŠIL, J. NETÍKOVA, J. HOLÁ Mid A. LOJEK 'Rtuwdll Maj mS; wind31 Aagml mS: ucnftrd IS Oclubir 1S93, Dílčí shrnutí: MOŽNÉ MECHANISMY (Indomethacin, Esculetin) Radiorezistence kmenových a prekurzorových buněk není ovlivněna !!! Efekty inhibitorů mohou být tedy způsobeny zásahy do biosyntézy eikosanoidů a jejich regulačními účinky na krvetvorbu 1OO -i 8O- ■ kontroly ■ indomethacin 6O- ■ cystamin " indomethacin + 4O cystamin 2O ■ z 1O (/) 8 m 6- 4- i \ 2- 1- 1 \ i i i i i 6 6.5 7 7.5 8 Dny po ozáření 6,5 Gy 14 5-i 4,5 43,5 3- 5 2M 2- o o - 1,5H 1 - 0,5 0J i-1-r kontroly indomethacin cystamin indomethan + cystamin ~~i-1-1-1 0 5 10 15 20 25 30 Dny po ozáření 6,5 Gy 15 150-, Dosažení dynamické rovnováhy v systému po podnětech rozdílné intenzity 10080 60 40 kontroly indomethacin cystamin indomethacin + cystamin 20 Í io ° 8- ľ) Cfl 8 UJ 64- 2 1- i i i i 6 6.5 7 7.5 Dny po ozáření 6,5 Gy 8 Vlastní výsledky Posílení inhibitorů COX ■ Kontrola ■ Cystamin ■ Indomethacin y^Hcystamínr+ Indomethacin Kombinovaná léčba kontroly indomethacin cystamin indomethan + cystamin 5 10 15 20 25 30 Dny po ozáření 6,5 Gy 0 5 10 15 20 25 30 Dny po ozáření 6,5 Gy Zátěž nižší intenzity optimum funkce Silně optimum poškozený ^ systém optimum funkce 17 Viz „negativní zpětná vazba" 18 Metabolická přeměna kyseliny arachidonové: Některé možnosti modulace i MEMBRÁNOVÉ POSFOLIPIDY I INDOMETHACIN DICLOPHENAC cyclooxygenazy f PROSTAGLANDINY THROMBOXANY PROSTACYCLINY KYSELINA ARACHIDONOVÁ SKF525A, 9-HE Y T l Zkratky: ETYA = 5,8,11,14 -eicosatetraynoic acid ESC = esculetin NDGA = nordihydroguaiaretic acid FLAP = 5-lipoxygenase activating protein 9-HE = 9-hydroxyellipticin HETEs = hydroxyeicosatetraenoic acids HPETEs = hydroperoxyeicosatetraenoic acids EETs = epoxyeicosatrienoic acids SKF525A = proadifen 12-lipoxygenaza 5-lipoxygenaza LEUKOTRIENY EETs HETEs DIOLS ^15-lipoxygenaza; 19 CELKOVE PRODUKTY LIPOXYGENÁZ A CYKLOOXYGENÁZ ~Crt7 Ä* O. Jí Esculetin 90 70 50 30 10 -10 -30 -50 -70 -90 10 30 100 koncentrace (|jMI) Ibuprofen 90 70 50 30 10 -10 -30 -50 -70 -90 -+- -+- H 3 10 30 100 koncentrace (|jMI) Indomethacin 90 70 50 30 10 -10 -30 -50 -70 -90 —I— 0,3 1 3 10 30 koncentrace (^M) i NDGA 90 70 50 30 10 -10 -30 -50 -70 -90 0,3 1 10 30 koncentrace (^Ml) Koncentračné závislé efekty inhibitorů AA na celkovou tvorbu jejích hlavních metabolitů v buňkách kostní dřeně myší VORE J.S. et al., J. Immunol. : 11, 435 -442, 1989 1 3 1 3 Hlavní dráhy biosyntézy eikosanoidu (metabolity hlavních os barevně): COX (purpurová) 5-LOX (oranžová), 15-LOX (zelená), 12-LOX (žlutá), CYP epoxygenase (červená), CYP w-hydroxylase (světle modrá), and nonenzymatic oxidation (šedá) J Lipid Res. 2009 June; 50(6): 1015-1038. Genomické a lipidomické studie: změny v biosyntéze eikosanoidů u makrofágů RAW264.7 (jako reakce na Kdo2-Lipid A stimulaci) Vyšší intenzita červené <> ukazuje zvýšené hladiny, U Vyšší intenzita zelené ukazuje snížené hladiny, Šedá - nezměněné hladiny J Lipid Res. 2009 June; 50(6): 1015-1038. E TD CD CM lu CS Ol Stimulus at t = 0 min Phospholipid EP2/EP4 cPLA2--PGHS-1 Early Phase Phospholipid »-tsPLA2 j AA *~t PGHS-2 j PGHS-1 i PGH2 tmPGHS-1 j PGE0 sPLA2--PGHS-2 Late Phase -30 30 60 Time (min) 90 120 150 T/BS Figure 4. The early and late phases of PGE2 biosynthesis in a model cell. Treating a resting cell, such as a serum-starved murine NIH 3T3 cell, with an appropriate stimulus leads to an early phase burst of PG synthesis involving cPLA2„ and constitutively expressed PGHS-1. In certain cells and with certain agonists, a second or late phase of prostanoid synthesis, involving primarily PGHS-2 and one or more sPLA2s, occurs. cPLA2„ is involved in the increase in sPLA2 activity in the late phase, and products formed via PGHS-1 promote the induction of PGHS-2 gene expression. Depending on the cell type and the stimulus (and thus the length of time the rate of PGHS-2 gene transcription is elevated), PGHS-2 protein levels can continue to increase for up to ~24 h or can begin to decrease after 2-3 h, at which time PGE2 synthesis stops. PGHS-1 does not appear to function in PG synthesis in the late phase. TRENDS in Biochemical Sciences Vol33 No.1 Negativní účinek PGE2 na proliferaci k. buněk + indomethacin cyklu Model: mitochondrial ROS signaling dictates biological outcomes. Stres-^ mediatory, AA, Eikosanoidy aj. Signaling events Senescence, death Adaptive Proliferation/ differentiation Direct damage to DNA/protein/lipids ROS levels TiBS Figure 4. Mitochondrial ROS levels are crucial for biological outcomes. Low levels of mitochondrial ROS production are required for cellular processes such as proliferation and differentiation. An induction in ROS production will lead to adaptive programs including the transcriptional upregulation of antioxidant genes. Even higher levels of ROS will signal the initiation of senescence and apoptosis. Non-signaling, irreversible damage to cellular components is only observed under the highest levels of cellular ROS. NDGA: duální inhibitor mediátorů PGs, LTs (po ozáření produkovaných ve velkých množstvích) Obdobně samotná AA: Zdroj lipidových peroxidů, ROS... Trends Biochem Sci. 2010 Apr 27. [Epub ahead of print] Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Hamanaka RB, Chandel NS PREŽÍVANÍ MYSI 120 100 80 60 40 20 Dicloph 0.15 mg p<0,01 Dicloph 0.5 mg p<0,05 Ibuprof 0.5 mg Ibuprof 0.15 mg p<0,01 Flurbiprof 0.5 mg Flurbiprof 0.15 mg p<0,05 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 POTENCIÁL VYUŽITI inhibitorů metabolismu AA V nádorové problematice in vivo Příklad působení NSAIDs u myší s nádorem (G:5:113) po terapii inhibitory COX týdny Hoferová et al.: 0 240 Journal of Leukocyte Biology Volume 62, August 1997 5-Lipoxygenase inhibitors potentiate effects of TGF-ßj on the differentiation of human leukemia HL-60 cells Alois Kozubík,* Jiřina Hofmanová* Ladislav Dušek,t and Eva Musilová* * Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic; and + Department of Environmental Studies, Masaryk University, Bmo, Czech Republic Příklad využití inhibitorů biosyntézy eikosanoidů in vitro MEMBRANE PHOSPHOLIPIDS ± Indomethacin Y CYCLOOXYGENASES PROSTAGLANDINS TROMBOXANES PROSTACYCLINS Posílení přirozených regulátorů diferenciace a apoptózy (TGF) pomocí různých inhibitorů přeměny AA nádorových Leukemických buněk 12-LIPOXYGENASE /U 12-HPETEs 12-HETEs 5 - LIPOXYGENASE LEUKOTRIEN ES „Diferenciační Terapie" Fig. 1. Formation of arachidonic acid metabolites by lipoxygenases, cyclooxygenases. and P450-monooxygenase system and mechanism of action of specific inhibitors of selected metabolic pathways. HPETEs, hydroperoxy acids: HETEs. monohydroxy acids: EETs. epoxy-eicosalrienoic acids; FLAP, 5-lipoxygenase-activating protein. „Diferenciační" účinky měřené pomocí chemiluminiscence (%) 450 -, A 40(1 350 g 300 o Q s 250 i 200 S 150- 51) 450 -i B Intaktní buňky TGF/ MK5 C f. - a S 150- 511 „předkultivace"DMSO 0 10 20 30 40 50 60 70 10 20 30 40 50 60 70 Time(minutes| Fig. 2. Chcmilumincsccncc rcs|>onsc of HI.-60 cells tn-atod for 48 h with 5-I.PO inhibitor Mk-886 |l or 5 u\I MK111 or VIK(5)|. TCF-B| 1400 pMl or with combination MkTCF-B|. Values are expressed as percentage of controls, which are represented as follows. (A| Experiment I. intact cells Ideteimination after 48 h of incubation): |B| Experiment 2. cells pretrealed with DMSO for 48 h (determination after % h of incubation). •Certain points within the vertical line an- significantly different tMann-W hilnev lest: P = 0.011. The character of the differences is described in text. Symbols an' as follows: filled diamonds. TCFBi: o|>cn triangles. MKfll: asterisks. MKI5I: filled circles. \1k(llTT;F-Bi: filled squares MK(5|/TCF-Bi. 500 450 400 E 350 á 5 300 250 200 U 150 100 50 TGF/ MK5 „předkultivace" RA 500 -1 450 - 400 0 B TGF/ esculetin „předkultivace"DMSO 0 10 20 30 40 50 60 70 0 10 20 30 40 50 60 70 Time (minutes) Fig. 3. Chcmilumincscencc response of HI.-60 cells treated for 48 h with 5-I.PO inhibitors. i.e. esculetin 112.5 uMl. Mk-886 [5 U.M: MK|5)|. TGF-Pi 1400 pM). or with their combinations. Values are expn-ssed as percentage of controls, which are represented bv cells pretn-ated for 48 It with RA lAl or with DMSO |R|. All data were obtained after % h of incubation. * Certain points within the vertical line are significantly different (Mann-Whitney test: P - 0.01). The character of ihe differences is described in the text. Symbols are as follows: filled diamonds. TCK-Bi; open triangles, esculetin; asterisks. Mklol: filled cinles MK(5)jTCF-Bi: filled squires, esculetiniTCF-|}i. ELSEVIER European Journal of Pharmacology 1 50 (l&PS) 273—2 34 Inhibitors of HnoxvFťnase met.nhohsm exert svnerPistir effects with retinoic acid on differentiation of human leukemia HL-60 cells Jiřina Hofmanová Aloi? Kozubík \ Ladislav DuSek b. Jiří Pachernik a 0 Itisriture of'Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic. Královopolská 1 35. CZ-612 65 Brna. Czech Republic FfepaťŤTtie}\í ofH}\i*iranjtiental tZhetxrisit-y -and jLCatoxic&lagv, Faculty of Sciences, \iasaryk University, Kotlářská 2. CZ-ll 37 Smo, C'zeci\ Republic ed 24 November 1997; re.vii.ed 25 March 199S, accepted il March 1998 MEMBRANE PHOSPHOLIPIDS \ t ARACHIDONIC ACID / (~r(WOXY(rF.^ASES 1 I PROSTAGLANDINS [KK0MB0\ANtS PROSTACYCLINS ' -ft* '.V. - KPETris HETEs c Kit Ilk" tin 5-LIPOXYGENASE jj > \ LEl'kDTaillMiS The effect ví iiihíbiliirí Fig. 1. Formation of arachidonic scid metabolites by lipos.vgeaii.vei. cvclo oxygenases and the P4;0-rnciric oxygenase system and the media ui sin cf action cf specific inhibitoiv of selected metabolic pathways-. The effects of inhibitors on HL-60 cell differentiation induced by retinoic acid or DMSO in the experiments prevented are shown vchernatically under ibe figure: ( —) no effect; the level of potentiation. HPETEv = hydroperoxy acids, HETEs = flaonohydroxy acids,: EETs = epoxy-eicosatrienoic acids; FLAP = 5-lipoxygenase- activating protein. některé hlavní CÍLE SOUČASNÉHO VÝZKUMU Poznání mechanismů působení látek lipidové povahy, zejména VNMK a jejich derivátů, v mezi- a vnitrobuněčných komunikacích podílejících se v regulaci cytokinetiky (proliferace, diferenciace a apoptózy) v kontextu jejich interakcí s - fyziologickými regulátory růstu, - environmentálními polutanty - vybranými farmaky. Jedním z praktických cílů je využít tyto znalosti v rámci přípravy lipidových nutričních preparátů, případně cytostatik. PREVENCE VYUŽITI CD-3 PUFA TERAPIE Epidemiologické studie - snížená incidence nádorů (kolonu) v populacích konzumujících velké množství w-3 VNMK z mořské stravy Experimentální studie • w-3 VNMK inhibují karcinogeny-indukovanou karcinogenezi • redukují růst transplantovaných nádorů u laboratorních zvířat • snižují proliferaci a indukují apoptózu u nádorových buněk kolonu in vitro. Klinické studie - EPA a DHA inhibují proliferaci epiteliálních buněk kolonu u pacientů s adenomy a vysokým rizikem nádorového onemocnění Při chirurgických zákrocích predoperační perorální nebo pooperační enterální či parenterální dieta s w-3 VNMK zlepšuje tr postoperační zánětlivou a imunitní odpověď a snižuje infekci. nádorovou kachexii a kvalitu života Kombinace se štandartní terapií (chemoterapie, záření) • dieta s w-3 VNMK netoxický způsob zvýšení účinků terapie • samotné použití w-3 VNMK užitečný přístup, jestliže je vyloučena toxická standardní terapie. Rakovina tlustého střeva - druhým nejčastějším nádorem u mužů hned po nádoru plic a u žen po nádoru prsu - ČR - vysoká incidence, přední ve statistikách, alarmující růst Proti nepříznivým účinkům některých VNMK (o>6) mohou působit mastné kyseliny s krátkým řetězcem - BUTYRAT ► produkován anaerobní mikrobiální fermentací vlákniny ve střevě ► zdroj energie pro normální kolonocyty ► významný pro udržení homeostázy ve střevní tkáni regulací exprese genů spojených s řízením proliferace, diferenciace a apoptózy (microarray analýza průkaz - změn exprese 19 400 genů), exportní protein mcti ► butyrát sodný (NaBt) snižuje proliferaci a indukuje diferenciaci a apoptózu neoplastických kolonocytů in vitro a in vivo \ Prevence NÁDORŮ TLUSTÉHO STŘEVA I Přechod adenom kaľcinom Námi využívané buněčné modely Buněčné línie fetáInÍ colon FHC adenomy AA/Cl RG/C2 adenocarcinoma / ,ü C V o .5 c HT-29 HCTll6 lymf. metastáza SW-620 Normal Mucosa Hyper-proliferation T Early Adenoma Intermediate Adenoma Late Adenoma i Carcinoma Metastases Účinky butyrátu Stimulation nf proliferation in the basal crypt Inhibition of nrol iteration in the upper crypt Inhibition of proliferation lulation of dilTerentiati Hypcracctylation of liistoncs ition Alterations in gene expression Pffccts on extracellular matrix Regression of carcinomatosis in vivo (acetate, propionate, butyrate) (butyrate) (butyrate) {butyrate, propionate) (butyrate) (butyrate) (butyrate) (interleukin-2 + butyrate) Předpokládané interakce tukových složek diety a endogenních regulátorů cytokinetiky epiteliálních buněk kolonu (exp. přístup) GUT-LUMEN X| n. Endogenní regulátory i lllĽJÍ (3mM) _s TNFc(j Nyjáidfja anti-Fas Dri A Rybí oleje EfflHBfi Plasmatická membrána Receptory smrti DR4, DR5 CD95 FA Cytoplasma Jádro PpAR PPRE Metody využívané na různých úrovních buněčné oraganizace plasmatická membrána Lipid packing Lipidové analýzy Phospholipidy (LC-MS-MS) Zastoupení MK (GC-MS) cytoplasma Lipid droplets flow cytometrie -Nile Red mitochondrie ROS -flow cytometrie (DHR-123) MMP - flow cytometrie (TMRE) Bc\-2 rodina (Western blotting) Jádro Transcriptční faktory, genová exprese Proliferace Diferenciace Apoptóza PUFAs (AA, DHA) zvyšují citlivost nádorových buněk kolonu k apoptóze indukované butyrátem nebo cytokiny rodiny TNF EurJ Nutr(2005) 44:40-51 Da 10.1007/500394-004-0490-2 ORIGINAL CONTRIBUTION DOI 1O.1O02/mnfr.20D80D175 Jiřina Hofmanová Alena Vaculová Antonín Lojek Alois Kozubík Mol. Nlltr. Food Ftes.2009, 53, 5102-511 3 Interaction of polyunsaturated fatty acids and sodium butyrate during apoptosis in HT-29 human colon adenocarcinoma cells Research Article Human fetal colon cells and colon cancer cells respond differently to butyrate and PUFAs Jiřina Hofmanová, Alena Vaculová, Zuzana Koubková, Martina Hýžďalová and Alois Kozu bik Available online at www.scienoedirectram ■ Ol INC E ^DIBIÍT' ELSEVIER Cancer Letten 22*1 (2005) 4.V4« Available online at ivwŕw.sclencedirect.ícinn fl C I E hi C.K ťff\ 11 k H ■ C T- Q&NCER ľhTi-Th ilhtl-il- Liľ.ľTjJjľť .luft j Jil g Polyunsaturated fatty acids sensitize human colon adenocarcinoma cells to death receptor-mediated apoptosis Jlo'lliu Ho fnrua ami *, ALeiiu VucuLovu, Alois Koiubilt C2-6I161 Sm. CStdt JUjnuWIt TRAIL and docosahexaenoic acid cooperate to induce HT-29 colon cancer cell death Alena Vaculová*1, Jiřina Hofmanová'1, Ladislav Aľidčľah, Alois KozubíkJ laboratory of Cytoj£ineticsr Institute of Biophysics. Afodeniy of Sciences of the Czech Republic, Královopolská 135.612 65 Srno. Czech Republic bLaôorotor, oj Ctil Signalling and Apoptosis, Instincts of Molecular Genetics, Vídenská JŕJAÍ, 142 20 Praha 4, Czech Rej Received ŕ> Navcmlxr2004: received in revised form 10 Dcccmbc^CÍH: accepted L3 Dcccmlxr 2004 ONCOLOGY REPORTS 19: 567-573, 2008 Response of normal and colon cancer epithelial cells to TNF-family apoptotic inducers IlRLNA HOFMANOVÁ, ALENA VACULOVÁ*, MARTINA HYZD'ALOVÁ* and ALOIS KOZUBÍK Laboratory of Cytokinetics, Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, v.vi.,Královopolská 135.CZ-612 65 Brno, Czech Republic Závěry Lipidy patří spolu s proteiny a sacharidy mezi hlavní složky výživy. Jsou nejen významným zdrojem energie, ale kromě DNA, bílkovin a cukrů představují i jedny z hlavních stavebních kamenů buněk. Významné je nejen jejich množství a kvalita v potravě, ale i frekvence příjmu. Kromě strukturní úlohy (jako složky membránových fosfolipidů) je neméně podstatná řada jejich funkčních vlastností. Změny spektra mastných kyselin (MK) v membránových strukturách mají dopad na membránovou fluiditu a další fyzikálně-chemické vlastnosti a tím zejména na interakce receptoru s jejich ligandy a další membránou zprostředkované buněčné funkce. MK/VNMK tak hrají důležitou úlohu v přenosu signálů z extracel. prostoru a fungují jako intra- i intercelulární mediátory a modulátory buněčné signalizační sítě. Hlavní mechanismy působení PUFAs v buněčných signalizacích 1) přímé ovlivnění aktivity transkripčních faktorů regulujících expresi genů významných z hlediska cytokinetiky 2) produkce eikosanoidů působících na přenos signálů růstových faktorů, cytokinů a imunitní systém 3) produkce ROS vznikajících peroxidací lipidů. MJoduJace cytokinetiky látkami tukové povahy Lipidy a zejména jejich složky VNMK včetně jejich metabolitů eikosanoidů, patří mezi významné faktory schopné ovlivnit jak dělení a zánik jak normálních, tak rovněž transformovaných buněk Tyto procesy lze příznivě modulovat, např. pomocí lipidových výživ anebo inhibicí produkce eikosanoidů pomocí NSAIDs Vše, co chcete vědět o lipidech http://www.cyberlipid.org/ Biologické „cíle" cisplatiny (adukty s DNA) Novel Concepts in the Development of Platinum Antitumor Drugs Curr. Med. Client. - Anti-Cancer Agents, 2002, Vol. 2, No. 4 3 Typy DNA ^w™* H%/NiU H:%/NH> aduktü /\ /\_ _G/X\G_ -c— —c—x—c- Intra- ,w.....m< a frekvence !! o- ! ■ í; jejjch výskytu (80-90%) *h? \p^NH3 M3M—Fj t—U L=CrpH20,S-R ■G \c- -G-X- -C-G- -C-Y- Inter- Inter- mOnO- Fig. (2). Types of cisplatin-DNA adducts and their frequency of formation. Fuertes, MA et al. Cytotoxic action and molecular basis of cisplatin ZH Siddik Cell Cycle A Checkpoints 4_ G1,S,G2 Arrest Apo ptosis Figure 1 An_overview_q£_pmhways_involved_in_medimin^ cisplm in-induced celliilur effect s. Cell death or cell survival will depend on the relative intensity of the signals generated and the crosstalk between the pathways involved. Some of the signaling discussed in the text has been omitted for clarity Molekulární podstata cytotoxického působení cisplatiny iniciované adukty DNA B. smrt závisí na relativní intenzitě Signálů LA-12 ? Oncogene (2003) 22, 7265-7279 Mutant p53 ,14*11] J| reg||la|;j0I1 KpS3 _L |XIAP ^lu^nj) \ (PI3K p2l)|-(Akt) 1 Caspases Fas J \- GSH-GApoptOSis, Fas Down-regulation Figuro 6 Disruption of p53-dopendenl apoplotic pathway in ci splal in-resisianl tumor cells Oncogene U buněk rezistentních k cisplatině je f-ce p53 (dráhy vedoucí k apoptóze)narušena. Přispívají k tomu změny v regulaci proteinů r. Bcl, Fas, Survivinu, Glutathionu Oncogene (2003} 22, 7265-7279 „Dose-response" křivky (mtt test) Nejcitlivější k cis-DDP Získaná rezistence Rada nádorů k cis-DDP Rezistentní A2780 A2780CÍS Cisplatin: IC50 = 1.34 uM ICS0 = 6.17, la-12: IC50 = 0.22 nM ICqq = 1.00 |lN ^ 3 « o o 6x 0.01 0.1 10 100 1000 Cisplatin: IC50 = 24.23 0 ICgo = 48.07 |iM LA-12: IC50= 1.40 |iM = 2.65 jlM 0.01 18x Concentration [i.lM] Faktor rezistence (18:6) = 3 0.1 1 10 100 Concentration [fiM] 1000 Fig. 2. Time- and close-response effects on the survival of A2780 and A278Gcis cancer cell lines. The effects after 72 h exposure to cisplatin or LA-12 in a concentration range between 0.3 \jM and 256 jjlM were determined by MTT assay. The calculated drug concentrations inhibiting metabolic activity of cells by 50% (IC50) and 90% (IC90) arc displayed for both derivatives. The results are expressed as mean 1 standard deviations (S.D.) of at least three independent experiments; all concentrations were tested in three replicates. Adamantylaminové Pt(II) a komplexy příklad praktického využití: látky lipofilní povahy (/asiJíiWnl 3 DNA) LA-9 NH3 Cl Cisplatina (II) Syntetizované F. Žákem a spol., PLIVA - Lachema Zak et al, 2004, J Med Chem, H,N 'C LA'5 381 f/mol H,N^_ „Cl Cl LA-i J44.ll g/mol HSIM ^Cl H;tJ Cl ch, LA-13 4tiJJZgfaAl redukce OCOCHj XI Pt(IV) Výhoda: H.N, HjN I Cl OCůch , H3N Cl Cl OCOCH, LA-Í 502J*fi^můJ OCOCK . Cl ;pt; OCOCH, LA-4 462,21 g/nul CH3 U-15 582,7fl g/mol lipofilní čtyřmocné Pt(IV) ^ (s DNA nereaktivní) LA-12 JM-216 1. z řady v klinickém zkoušení Opakovaně prokazovaná vysoká účinnost LA-12 in vitro i in vivo !!!!! 1. fáze klin. hodnocení Rozdílný vliv cisplatiny a LA-12 na buněčný cyklus „citlivé" A2780 (single staining) Souvisí změny v proliferaci se změnami v regulaci b.c.? A2780 UNTREATED CONTROL GO/G1. 43.5 ± 2.5 % S: 39.2 ± 6.0 % g2/M: 17.3 ±5.5% 2 A hr h 48 hr GO/61: 71.2 ±6.9% S: 35.3 ± 6.8 % G2/M: 14.0 + 3.0% G0'G\21.S±4.1 %(•) s: 35^ 4.3 % GfiwM-0 ± 5.5 % (') G2/M GQ'GI 45.5 ±6.4 % S: 24.5 + 6.3 % G2'M: 24.0 ± 6.7 % (*) LA-12(50) GO/G1: 27.6 ± 3.5 %(*) S: 49.12 - 7.4% (#) G27M: 23.12 ±5.4 %(#) G0/G1:54.1 ±6.5% S: 29.8 ± 5.4 % G2/M: 21.32 ±1.5% 72 hr G0/G1: 71.2 ±6.9% S: 15.8 ±2.2% G2/M; 82 ±1.3% G0,G1:45.5 ± 6.4 %C) S 33.2 ±3.1 % C) G2;M:21.3 + 86% 0001:54.11 i 6.5%C) S. 29.3 ± 3.4 % (*) G2/M: 16.6t32% Kozubik et al, 2005, Biochem Pharmacol Rozdilny vliv cis-DDP a LA-12 na bunecny cyklus A2780cis A2780cis UNTREATED CONTROL G0/G1: 44 2 - 4.9 % S 38 9 ± 3.2 % G2/M: 16.9 ±4.5% 24 hr 43 hr G0/G1: 51.1 i 4.4% S: 33.5 ± 1.9 % G2/M: 154 ±2.9% G0/G1: 17.9 ± 6.8 % (*) S: 66.01 4.9 % (*) G2M: 20.7 ± 6.9 % G0/G1: 184 +10.0 %(*) S: 47.0 ± 16.7% G2/M: 34.6+ 12.4% (x) LA-12(50) G0/G1: 29.2 ± S.9 % (*) S: 53.7 + 2.6 % (*#) G2/M: 19.8 ±0.8% G0/G1: 24.3 ± 6.3 %(*) S: 41.1 - 8.1 % G2/M: 34.6 1 3.2 % (x) Kozubik al., 2005, Biochem Pharmacol Účinky LA-12 a cisplatiny na b. cyklus jsou u ovariárních nádorových linií rozdílné. Detekovány hladiny proteinů: - Cyklin A, B1, cdk2 ( +) regulace b. cyklu); - p21, Gadd45a („p53 target genes" -)regulace b. cyklu); - Bax (apoptóza); - Gadd 45a („DNA repair"); - Mdm2 (regulace stability p53) Hladiny proteinů regulujících buněčný cyklus (cyklin A, B1, cdk2) u buněk A2780 a A2780cis po působení LA-12 a cisplatiny 6 h A2780 A2760CÍS 12 h A2780 A2780cis 24 h A2780 A2780cis cyclin a Fold increase LQ 03 03TO O TT 10 11 10 1.0 1.1 1.2 1.0 1.2 11 10 13 11 cdk2 Folduicrease 1.0 1.0 1.0 1.0 1.1 1.1 1.0 1.0 0.8 1.0 1.2 1.1 1.0 1.0 1.0 1.0 1.2 0.8 cyclin B1 Foldincrease 1.0 0.9 0.8 1.0 0.9 0.9 1.0 1.1 1.1 1.0 1.1 1.2 1.0 1.3 1.3 1.0 1.4 1.2 P-actin Nebyly pozorovány žádné změny vč. Bax (apOptČ>za); Gadd 45a („DNA repair"); Mdm2 (regulace stability p53) 50 Exprese PARP a p53 (Western b.) u A2780 a A2780cis A2780 A2780cis (a) PARP 24 h p53 1 o 5 ř ô :> 0 1 ši "9 [5 > r S ;> 24 h 1 3.1* 4.6* 1.4» 1.6* «.1 0.8" 24 ll 1 d 2± 1.1* 8.2* 1.0* 2.5* [1.2" 2.8* 9.9° 48 li 1 4.1* 1.4 6.8* 1.8* 2.6* 0.2 4.8* 1.9* 48h 1 6.8* 1.9« O.J* 3.2* (I. 5" 3.4* 0,6" 72h 1 0.6* 3.7* 0.7* 1.6± 0.2 2.5* 0.6* 72h I 5.61 2.0* 7.0* 2.8« il.K 3.3* 1.0 (d) p-actin 42kDa Fig. 8. Western blot analyses of (a) PARP (upper panel) and (b) p53 (middle panel) protein levels in A2780 (left panel) and A2780cis cells (right panel). The cells u ere nol exposed I untreated controls) or exposed to 1CS(, oi IC)(I conccntraiions of cisplaiin or LA-1J and harvested at 24 h.4S h. and 72 n of sustained drug treatment. One representative experiment of at least three is presented. Table (c) contains values of p53 expression quantified by densitometry (mean ± S.D. of at least three independent experiments). The symbols (*) denote significant difference (p < 0.05) from untreated control; (#) denote significant difference (p < 0.05) between equitoxic cisplatin and LA-12 effects. Equal loading is documented by detection of (d) (3-actin (bottom panel). Equitoxické koncentrace cis-DDP indukují vyšší expresi proteinu p53 (teoreticky vyšší poškození DNA, než po apl. LA-12 a tudíž by cis-DDP měla působit efektivněji), Nebylo tomu tak, tzn. že by musí existovat jiné. např. s poškozením DNA nesouvisející mechanismy působení LA-12 !!!!!! Kozubik et al, Biochem Pharmacol., 2005 Tyto výsledky se zařazují mezi ty přístupy, i když plně nevysvětlují působení cisplatiny a LA-12, které výzkum platinových cytostatik posouvají do nových oblastí. Studie z poslední doby ukazují, že cisplatina inhibuje růst nádorových buněk v koncentracích, které jsou významně nižší, než konc. potřebné pro inhibici syntézy DNA. To naznačuje, že mohou existovat i jiné mechanismy působení než ty, které jsou primárně založeny na poškození DNA Platinová cytostatika mohou reagovat s dalšími buněčnými strukturami (komponenty) jako jsou: > RNA, > proteiny, > cytoskeletální filamenta, > thioly- obsahující molekuly > membranové fosfolipidy. Odvozené mechanismy mohou být významnou součástí signálních kaskád regulujících dělení a smrt buněk Předpoklad: Vzhledem ke své lipopfilicitě, lze očekávat, že alespoň některé příznivé efekty působení LA-12 by mohly být (alespoň částečně), spojeny s interakcemi této látky se složkami b. membrán. (anebo by mohly být modulovány ovlivněním memb ^^BT^£ LA-12 indukuje „upregulacľ'proteinu DR5, mRNA a zvyšuje zastoupení DR5 v lipidových raftech Zastoupení DR5 a DR4 v membránách S 5 ~z > A v z o 3 '3! tr. e 2 Q. H u ■! k a 0 ■ HR4 □ DR5 cisplatin (^M) LA-1Z (::M) 0.1 0.5 1 1.5 - HCT 116 - I Celkové hladiny DR5 (rafty) Celkové hladiny DR5 2 0 1.5 Í 1 0.5 cisplatin LA-12 control cisplatin LA-12 Lokalizace DR5 v lipidových raftech Využití mechanismů působení pt-cytostatik jiných než těch, které přímo souvisí s poškozením DNA Posílení terapeutických efektů ? -► Lipidové výživy vhodného složení