Základy genomiky V., Protein-protein interakce Logo1me Logo1me Základy genomiky VI. Analýza protein-proteinových interakcí Závěrečná diskuse - praktické aplikace funkční genomiky Jakub Horák Masarykova univerzita, Laboratoř funkční genomiky a proteomiky Laboratoř molekulární fyziologie rostlin Základy genomiky V., Protein-protein interakce Logo1me §Zdrojová literatura ke kapitole VI: Základy genomiky VI. §Grefen et al., Molecular Plant, 2008 §Van Leene et al., Trends in Plant Science, 2008 §Walter et al., Plant Journal, 2004 §Wilt and Hake, Principles of Developmental Biology §Horak et al., BMC Plant Biology, 2008 Základy genomiky V., Protein-protein interakce Logo1me Genomika VI. §Metody analýzy proteinových interakcí in vivo §tandemová afinitní purifikace (TAP-tag) §kvasinkový dvouhybridní test (Y2H) §Podstata a funkční význam proteinových interakcí §chemická podstata proteinových interakcí §proteinové interakce - klíč biologické funkce proteinů §bimolekulární fluorescenční komplementace (BiFC) §analýza zprostředkované membránové vazby (MeRA) §koimunoprecipitace (Co-IP) Základy genomiky V., Protein-protein interakce Logo1me Genomika VI. §Podstata a funkční výzam proteinových interakcí §postranní řetězce aminokyselin vstupují do nekovalentních interakcí, které jsou rozhodující pro sbalování proteinů a jejich interakci s dalšími molekulami včetně jiných proteinů § §většina proteinů v buňce existuje ve formě komplexů, které mohou dále navzájem interagovat, vytváření interakcí je podstatou biologické funkce strukturních proteinů, regulačních a signálních proteinů, protilátek i enzymů §signální kaskády využívající cAMP c:\chap02\02_bx01.jpg §sestřih hnRNA interakce 5 snRNA a více než 50 proteinů §regulace buněčného cyklu §vývojově specifické procesy např. regulace buněčné diferenciace během embryonálního vývoje u Drosophily 03_19.jpg 0004CBE3Macintosh HD B746699A: §přenos signálu prostřednictvím G proteinu a fosfolipasy C Základy genomiky V., Protein-protein interakce Logo1me Genomika VI. §Metody analýzy proteinových interakcí in vivo §tandemová afinitní purifikace (TAP-tag) §kvasinkový dvouhybridní test (Y2H) §Podstata a význam proteinových interakcí §chemická podstata proteinových interakcí § §proteinové interakce – klíč biologické funkce proteinů §bimolekulární fluorescenční komplementace (BiFC) §analýza zprostředkované membránové vazby (MeRA) §koimunoprecipitace (Co-IP) Základy genomiky V., Protein-protein interakce Logo1me Adobe Systems Genomika VI. §Metody analýzy proteinových interakcí in vivo §koimunoprecipitace §založena na izolaci proteinových komplexů pomocí protilátek rozpoznávajících jeden z interagujících proteinů §jednou z metod využívajících princip koimunoprecipitace je tzv. pull-down assay, která se využívá zejména pro potvrzení interakcí u proteinů, kde již tuto interakci předpokládáme CKI1 MYC CKI1 HA αMYC αHA CKI1 MYC AHK3 HA αMYC Základy genomiky V., Protein-protein interakce Logo1me Genomika VI. §Metody analýzy proteinových interakcí in vivo §tandemová afinitní purifikace (TAP-tag) §izolace proteinových komplexů pomocí rekombinantních proteinů, fúzovaných s dvěma různými vazebnými doménami §proteiny izolovaných komplexů jsou po rozdělení na 1D ELFO identifikovány pomocí MS §calmodulin-binding protein (CBP) §IgG vázající domény proteinu A (ProtA) §místo rozpoznávané specifickou proteázou z TEV viru (tobacco etch virus) POI §výhodou je použití dvou nezávislých proteinových domén pro afinitiní purifikaci a tedy velká specificita Základy genomiky V., Protein-protein interakce Logo1me Genomika VI. §Metody analýzy proteinových interakcí in vivo §dvouhybridní kvasinkový test (Y2H) §Detekce proteinového komplexu pomocí funkční rekombinace dvou nezávislých domén transkripčního faktoru §jeden z proteinů (návnada, bait) fúzovaný s DNA vazebnou doménou Gal4 (Gal4-BD) §druhý z proteinů (kořist, prey) fúzovaný s aktivační doménou Gal4 (Gal4-AD) §Interakce proteinů umožní rekonstituci vazebné domény s aktivační doménou a spuštění reportérového genu §vizuální detekce (modré zbarvení, LacZ) §auxotrofní selekce (růst na médiu bez histidinu, His) §umožňuje vyhledávání interakčních partnerů v expresních knihovnách jednotlivých organismů a tkání Základy genomiky V., Protein-protein interakce Logo1me Genomika VI. §Metody analýzy proteinových interakcí in vivo §bimolekulární fluorescenční komplementace (BiFC) § §Proteinová interakce je detekována na základě reasociace fluoreskujícího proteinu §každý z potenciálních interakčních partnerů je fúzován s jednou z podjednotek fluoreskujícího proteinu, např. YFP §při interakci dojde ke znovuobnovení fluorescence §Kromě identifikace vlastní interakce umožňuje i lokalizovat interakci v buňce N-YFP protein 1 C-YFP protein 2 žádný signál interakce N-YFP protein 1 C-YFP protein 2 BiFC YFP Základy genomiky V., Protein-protein interakce Logo1me Genomika VI. §Metody analýzy proteinových interakcí in vivo §bimolekulární fluorescenční komplementace (BiFC) § §Proteinová interakce je detekována na základě reasociace fluoreskujícího proteinu §každý z potenciálních interakčních partnerů je fúzován s jednou z podjednotek fluoreskujícího proteinu, např. YFP §při interakci dojde ke znovuobnovení fluorescence §Kromě identifikace vlastní interakce umožňuje i lokalizovat interakci v buňce § §BiFC patří do metod, které jsou v současnosti označovány PCA (Protein Complementation Assay) (např. split-LUC aj.) a v modifikované verzi je možné analyzovat více interakcí jednoho proteinu současně (multicolor BiFC) BiFC_Nature.jpg Základy genomiky V., Protein-protein interakce Logo1me Genomika VI. §Metody analýzy proteinových interakcí in vivo §analýza zprostředkované membránové vazby (MeRA) Základy genomiky V., Protein-protein interakce Logo1me Genomika VI. §Metody analýzy proteinových interakcí in vivo §analýza zprostředkované membránové vazby (MeRA) GFP GFP GFP GFP P35S::ERS1:RFP + P35S::ΔTM-ETR2:GFP Základy genomiky V., Protein-protein interakce Logo1me Genomika VI. §Metody analýzy proteinových interakcí in vivo §analýza zprostředkované membránové vazby (MeRA) §Umožňuje identifikaci interakcí cytoplazmatických proteinů s membránovými proteiny §membránový protein je fúzován s fluoreskujícím proteinem §potenciální ineterakční partner je fúzován s jimým fluoreskujícím proteinem, lišícím se svým emisním spektrem §v případě interakce dojde ke změně lokalizace cytoplazmatického proteinu na membránu (kolokalizaci s membránovým proteinem) Základy genomiky V., Protein-protein interakce Logo1me Genomika VI.-shrnutí §Metody analýzy proteinových interakcí in vivo §tandemová afinitní purifikace (TAP-tag) §kvasinkový dvouhybridní test (Y2H) §Podstata a funkční význam proteinových interakcí §chemická podstata proteinových interakcí § §proteinové interakce – klíč biologické funkce proteinů §bimolekulární fluorescenční komplementace (BiFC) §analýza zprostředkované membránové vazby (MeRA) §koimunoprecipitace Základy genomiky V., Protein-protein interakce Logo1me Genomika VI. Diskuse Základy genomiky V., Protein-protein interakce Logo1me Genomika VI. Závěrečná diskuse Praktické aplikace funkční genomiky: §individualizovaná medicína („personalized medicine“) § §pokročilé biotechnologie §šlechtění rostlin Základy genomiky V., Protein-protein interakce Logo1me Genomika VI. Závěrečná diskuse Individualizovaná medicína („personalized medicine“) Jedná se o lékařský přístup, který klade důraz na systematické využití informací o jednotlivém pacientovi za účelem vytvoření individuálně optimalizovaného preventivního a terapeutického plánu. Některé předpoklady: §detailní znalost genomu pacienta, ideálně kompletní genomová sekvence §znalosti funkce jednotlivých genů včetně funkčních odlišností jednotlivých alel zastoupených v populaci §korelace sekvenčních charekteristik s prognózami onemocnění, s úspěšností terapeutických postupů atd. Základy genomiky V., Protein-protein interakce Logo1me Genomika VI. Závěrečná diskuse Pokročilé biotechnologie http://www.efb-central.org Některé příklady: §efektivní využití rostlinné biomasy pro výrobu paliv §získávání základních jednotek pro výrobu polymerních látek z živých organismů místo z fosilních zdrojů §fytofarmaceutika – nové metody vakcinace jako je například exprese protilátek, nebo antigenů vhodných k imunizaci v rostlinách Základy genomiky V., Protein-protein interakce Logo1me Genomika VI. Závěrečná diskuse Šlechtění rostlin http://www.efb-central.org http://www.gmo-compass.org/ http://www.ugent.be/we/genetics/ipbo/en Některá fakta k zamyšlení: §naše civilizace je postavena na zemědělství, za 10.000 let jeho existence klesla plocha potřebná k obživě jedince o 90% §k zabránění kolapsu je třeba tuto plochu dále snížit a to ze současných 0,45 ha/osobu až na 0,2 ha/osobu a to do roku 2050 §návrat k původním metodám zemědělství je návratem k původním nárokům na plochu k obživě a je tedy dlouhodobě neudržitelný (Jaké trendy vidíme kolem sebe v Evropě? Jak se to slučuje se solidaritou k rozvojovým zemím?) §intenzivní zemědělství = konverze vody a ropy na potraviny §cílem rostlinných biotechnologií je využít všech dostupných poznatků vědy ke šlechění odrůd s větším výnosem při menších nákladech na vodu a hnojiva §je nutná obhajoba GMO rostlin („biotech crops“) před veřejností, neboť toto budou plodiny 21. století rostoucí v lepším životním prostředí §neakceptovatelnost nových metod z ideologických důvodů staví každého vědce do obtížné situace boje s nerozumem, kterému musí s plným nasazením čelit § Základy genomiky V., Protein-protein interakce Logo1me Genomika VI. Závěrečná diskuse Váš úkol: §neúnavně vysvětlovat, že využívání vědeckých poznatků, a to včetně genomiky, je nutné kromě pokroků v medicíně také pro zachování planety a naší civilizace § §diskuse s širokou veřejností o významu a přínosech GMO pro lidskou společnost