Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Logo1me Základy genomiky V. Metody funkční genomiky Jan Hejátko Masarykova univerzita, Laboratoř funkční genomiky a proteomiky Laboratoř molekulární fyziologie rostlin Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me §Zdrojová literatura ke kapitole IV: Základy genomiky V. §Plant Functional Genomics, ed. Erich Grotewold, 2003, Humana Press, Totowa, New Jersey § §Surpin, M. and Raikhel, N. (2004) Traffic jams affect plant development and signal transduction. Nature Reviews/Molecular Cell Biology 5,100-109 § §Zouhar, J., Hicks, G.R. and Raikhel, N.V. (2004) Sorting inhibitors (Sortins): Chemical compounds to study vacuolar sorting in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., 101, 9497–9501 § §Lueking et al. (2005) Protein biochips: a new and versatile platform technology for molecular medicine. Drug Discov Today., 10, 789–794 § Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me §Fenotypové profilování Genomika V. §metabolické profilování §DNA a proteinové čipy §Metody identifikace funkce genů pomocí přístupů získané funkce §T-DNA aktivační mutageneze §ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese §metody mikrodisekce §Metody využívané ve funkční genomice rostlin §PCR §A. thaliana jako modelový organizmus funkční genomiky rostlin §Analýza genové exprese §Metody kvalitativní analýzy genové exprese Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Genomika V. §Nové trendy §chemická genetika Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me §Metody analýzy genové exprese Genomika V. analýza genové exprese §Kvalitativní analýza exprese genů §Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s reporterovým genem (gen zpravodaj) Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me □Transkripční fůze s promotorovou oblastí §Identifikace a klonování promotorové oblasti genu §příprava rekombinantní DNA nesoucí promotor a reportérový gen (uidA, GFP) §příprava transgenních organismů nesoucích tuto rekombinantní DNA a jejich histologická analýza Genomika V. analýza genové exprese pic_1 pic_2 TATA box počátek transkripce promotor 5’ UTR ATG…ORF reportérového genu fig_1 Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me §Metody analýzy genové exprese Genomika V. analýza genové exprese §Kvalitativní analýza exprese genů §Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s reporterovým genem (gen zpravodaj) §Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s reporterovým genem Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me □Translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s repotérovým genem §Identifikace a klonování promotorové a kódující oblasti analyzovaného genu §příprava rekombinantní DNA nesoucí promotor a reportérový gen (uidA, GFP) ve fůzi s genem zájmu §příprava transgenních organismů nesoucích tuto rekombinantní DNA a jejich histologická analýza Genomika V. analýza genové exprese §oproti transkripční fůzi umožńuje analyzovat např. intracelulární lokalizaci genového produktu (proteinu) nebo jeho dynamiku TATA box počátek transkripce promotor 5’ UTR ATG…ORF analyzovaného genu….ATG…ORF reportérového genu….....STOP fig_1 Histone 2A-GFP in Drosophila embryo by PAM ΔTIP-GFP, Erhardt’s line, tonoplast movement Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me §Metody analýzy genové exprese Genomika V. analýza genové exprese §Kvalitativní analýza exprese genů §Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s reporterovým genem (gen zpravodaj) §Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s reporterovým genem §Využití dostupných publikovaných dat Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me §Genevestigator (https://www.genevestigator.com/gv/index.jsp) § Genomika V. analýza genové exprese Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me □Analýza exprese pomocí Genevestigator (AHP1 a AHP2, Arabidopsis, Affymetrix ATH 22K Array) Genomika V. analýza genové exprese Genevestigator_AHP1_anat.jpg Genevestigator_AHP2_anat.jpg Genevestigator_AHP1_dev.jpg Genevestigator_AHP2_dev.jpg Genevestigator_AHP1_stimulus.jpg Genevestigator_AHP2_stimulus.jpg Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me §Genevestigator (https://www.genevestigator.com/gv/index.jsp) § §Arabidopsis eFP Browser (http://www.bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi) Genomika V. analýza genové exprese AHP1 expression AHP1 subcellular localization Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me §Genevestigator (https://www.genevestigator.com/gv/index.jsp) § §Arabidopsis eFP Browser (http://www.bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi) §Mouse eFP Browser (http://www.bar.utoronto.ca/mouse_efp/cgi-bin/efpWeb.cgi) § Genomika V. analýza genové exprese BMP4 expression Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Genomika V. §Metody identifikace funkce genů pomocí přístupů získané funkce §T-DNA aktivační mutageneze §ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese §Analýza genové exprese §Metody kvalitativní a kvantitativní analýzy genové exprese Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me §Metody identifikace funkce genů pomocí přístupů získané funkce §T-DNA aktivační mutageneze Genomika V. §metoda umožňující izolaci dominantních mutantů prostřednictvím náhodné inzerce konstitutivního promotoru, vedoucí k nadměrné expresi genu a tím odpovídajícím fenotypovým změnám §prvním krokem je příprava mutantní knihovny připravené pomocí transformace silného konstitutivního promotoru nebo zesilovače §následuje vyhledávání zajímavých fenotypů §identifikace zasaženého genu např.pomocí plasmid-rescue Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me TF TF TF 40S 60S TF TF TF TF 40S 60S 40S 60S 40S 60S 40S 60S Genomika V. aktivační mutageneze TF TF TF Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Izolace genu CKI1 - izolace genu pomocí aktivační mutageneze - mutantní fenotyp je fenokopií exogenní aplikace cytokininů (CKI1, CYTOKININ INDEPENDENT 1) * - Tatsuo Kakimoto, Science 274 (1996), 982-985 * * no hormones t-zeatin K1 K2 plasmid rescue 35S::CK1 cDNA Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Genomika V. §Metody identifikace genů pomocí přístupů získané funkce §T-DNA aktivační mutageneze §ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Genomika V. §Systémy regulovatelné genové exprese §umožňují časovou nebo místně specifickou regulaci genové exprese, vedoucí ke změně fenotypu a tím identifikaci přirozené funkce genu §pOP systém Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me 35S LhG4 pOP TATA CKI1 activator reporter activator x reporter x Genomika V. systémy regulovatelné exprese, pOP Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me 35S LhGR pOP TATA CKI1 activator reporter activator x reporter DEX DEX +DEX DEX DEX DEX x Genomika V. systémy regulovatelné exprese, pOP Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me 35S LhGR pOP TATA CKI1 activator reporter activator x reporter DEX DEX +DEX DEX DEX DEX x pOP TATA GUS DEX DEX 4C Genomika V. systémy regulovatelné exprese Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Genomika V. §Systémy regulovatelné genové exprese §umožňují časovou nebo místně specifickou regulaci genové exprese, vedoucí ke změně fenotypu a tím identifikaci přirozené funkce genu §pOP systém §UAS systém http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/ Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me §Fenotypové profilování Genomika V. §DNA a proteinové čipy §Metody identifikace genů pomocí přístupů získané funkce §T-DNA aktivační mutageneze §ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me §Fenotypové profilování §DNA a proteinové čipy Genomika V. §metoda umožňující rychlé porovnání velkého množství genů/proteinů mezi testovaným vzorkem a kontrolou §nejčastěji jsou používané oligo DNA čipy §k dispozici komerčně dostupné sady pro celý genom §firma Operon (Qiagen), 29.110 70-mer oligonulkleotidů reprezentujících 26.173 genů kódujících proteiny, 28.964 transkriptů a 87 microRNA genů Arabidopsis thaliana §možnost používat pro přípravu čipů fotolitografické techniky-usnadnění syntézy oligonukleotidů např. pro celý genom člověka (cca 3,1 x 109 bp) je touto technikou možno připravit 25-mery v pouźe 100 krocích) Affymetrix ATH1 Arabidopsis genome array §čipy nejen pro analýzu exprese, ale např. i genotypování (SNP polymorfizmy, sekvenování pomocí čipů, …) Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Genomika V. DNA čipy §DNA čipy, analýza výsledků §pro správnou interpretaci výsledků je nutná dobrá znalost pokročilých statistických metod §kontrola na přesnost měření (opakované měření na několika čipech se stejným vzorkem, vynesení stejných vzorků analyzovaných na různých čipech proti sobě) §je nutné zahrnout dostatečný počet kontrol i opakování §kontrola reproducibility měření (opakované měření s různými vzorky, izolovanými za stejných podmínek na stejném čipu-stejné podmínky proti sobě) Che et al., 2002 §identifikace hranice spolehlivého měření nespolehlivé spolehlivé §konečně vynesení experimentu proti kontrole nebo různých podmínek proti sobě – vlastní výsledek §v současnosti je již velké množství výsledků různých experimentů lokalizovaných ve veřejně přístupných databázích Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me §Proteinové čipy §čipy s vysokou denzitou obsahující řádově 104 proteinů Genomika V. proteinové čipy §analýza protein-proteinových interakcí, substrátů kináz a interakcí s malými molekulami §možnost použít protilátky – stabilnější než samotné proteiny Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me §Identifikace proteinů interagujících s cytoplasmatickou částí integrinu αIIbβ3 krevních destiček §exprese cytoplasmatické části jako fůzního peptidu biotin-KVGFFKR Genomika V. proteinové čipy §analýza vazby s proteinovým čipem obsahujícím 37.000 klonů E.coli exprimujících lidské rekombinantní proteiny §potvrzení interakce pull-down analýzou peptidů i koprecipitací celých proteinů (chloridový kanál ICln) §další využití např. při identifikaci substrátů kináz, kdy substráty jsou navázány na čip a vystaveny působení kináz za přítomnosti radiokativně značeného ATP (768 purif. proteinů ječmene, z nich 21 identifikováno jako subtráty kinázy CK2α, Kramer et al., 2004) Lueking et al., 2005 Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me §Fenotypové profilování Genomika V. §Metody využívané ve funkční genomice rostlin §metabolické profilování §PCR §DNA a proteinové čipy §Metody identifikace genů pomocí přístupů získané funkce §T-DNA aktivační mutageneze §ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese §metody mikrodisekce §proteomické přístupy §A. thaliana jako modelový organizmus funkční genomiky rostlin Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me §malé nároky na kultivační plochu Arabidopsis thaliana huseníček polní, mouse-ear cress §velké množství semen (20.000/rostlinu a více) § §malý a kompaktní genom, (125 MBp, cca 25.000 genů, prům. velikost 3 kb) § §5 chromozomů §vhodná pro široké spektrum fyziologických experimentů § §velká přirozená variabilita (cca 750 ekotypů (Nottingham Arabidopsis Seed Stock Centre)) Col-0 Columbia 0 Ler-0 Landsberg 0 Ws-0 Wassilewskija 0 http://seeds.nottingham.ac.uk/ 05arab Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Entrez records Database name Direct links Nucleotide 618,539 Protein 118,482 Structure 61 Genome 7 Popset 106 SNP 184 3D Domains 162 Domains 47 GEO Datasets 6 GEO Expressions 61,406 UniGene 25,447 UniSTS 612 PubMed Central 3,864 Gene 30,273 Taxonomy 1 Arabidopsis, významný rostlinný model TAIR, http://www.arabidopsis.org/info/aboutarabidopsis.jsp National Science Foundation, USA,¨, http://www.nsf.gov/bio/pubs/arabid/chap1.htm Počet záznamů v databázi „PubMed“ (MEDLINE) vyhledaných pod heslem „Arabidopsis“ 25.690/29.146 (16.10. 2008/22.10. 2009, meziroční nárůst 13%). (Pro srovnání, pod heslem „human“ nalezeno 10 620.405/ 11 151.170 záznamů), nárůst 5%. Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me PCR Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Genomika V. §Nové trendy §pojem chemická genetika – 60.997 záznamů v databázi PubMed (20.10. 2010) §podobně jako v případě gentiky „klasické“ existují i zde přístupy „přímé“ a „reverzní“ §oproti přístupům „klasické“ genetiky není předmětem zájmu gen ale protein §chemická genetika se snaží identifikovat buď cílový protein po chemickém působení a následných fenotypových změnách („přímá“ chemická genetika) nebo naopak chemikálie schopné interakce s proteinem zájmu („reverzní“ chemická genetika) §za tímto účelem jsou prováděna vyhledávání v knihovnách nejrůznějších chemických látek (tisíce položek, komerčně přístupné) §příklad: analýza endomembránového transportu u rostlin §chemická genetika Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Genomika V. chemická genetika §Analýza mechanismů endomembránového transportu přístupy chemické genetiky §v rostlinných buňkách dochází k velice dynamickým procesům, zprostředkovávaným zejména tzv. endomembránovým transportem (viz film, GFP směřované do ER) §endomembránový transport je důležitým regulačním mechanismem při přenosu signálu a regulaci buněčných procesů secretion_pthways Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Genomika V. chemická genetika §Analýza mechanismů endomembránového transportu přístupy chemické genetiky §pomocí vyhledávání v „knihovně“ chemických látek byly identifikovány takové, které vedou u kvasinek (S. cerevisiae) k sekreci enzymu (karboxipeptidázy Y), která je normálně transportována pomocí endomembránového transprtu do vakuoly §identifikované látky („sortiny“) byly schopny vyvolat obdobné změny i u Arabidopsis (konzervované mechanismy transportu u kvasinek i u rostlin) §analýza změny sekrece pomocí dot-blotu a imunodetekce karboxipeptidázy Y v kulti-vačním médiu pomocí monoklonálních protilátek §pro bližší identifikaci molekulárního procesu ovlivněného jedním z identifikovaných „sortinů“ byla provedena analýza jeho vlivu na sekreci markerového proteinu (AtCPY) – sortin 1 inhibuje specificky pouze tuto sekreční cestu §pomocí EMS mutageneze identifikace mutantů se změněnou citlivostí k sortinu 1 (hyper- nebo hypo-senzitivní mutanti) yeast screen Zouhar et al., 2004 chemická struktura sortinů detekce vakuolárního fenotypu (tvaru tonoplastu) kvasinek pomocí barvení specifickou barvou (MDY-64) Imunodetekce karboxypeptidázy tvar rostlinných vakuol pomocí EGFP:-TIP fenotyp semenáčků v přítomnosti sortinů Sortin 1 Sortin 2 Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Genomika V. chemická genetika §Analýza mechanismů endomembránového transportu pomocí chemické genetiky - shrnutí §GFP::d-TIP značení mebrány vakuoly (tonoplastu) a identifikace mutací vedoucí ke změně morfologie tonoplastu § §chemická genetika v kombinaci s klasickou genetikou - identifikace proteinů zúčastńujících se regulace endomembránového transportu § §proteomické přístupy – identifikace a analýza proteomu vakuol § Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me §Fenotypové profilování §metabolické profilování §DNA a proteinové čipy §Metody identifikace funkce genů pomocí přístupů získané funkce §T-DNA aktivační mutageneze §ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese §metody mikrodisekce §Metody využívané ve funkční genomice rostlin §A. thaliana jako modelový organizmus funkční genomiky rostlin §PCR Genomika V. Shrnutí Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me §Nové trendy §chemická genetika Genomika V. Shrnutí Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Logo1me Genomika V. Diskuse