• SYNTETICKÉ OLIGONUKLEOTIDY Hana Konečná CENTRÁLNÍ LABORATOŘ Masarykovy Univerzity v Brně LOGO Oddělení funkční genomiky a proteomiky Přírodovědecká fakulta Masarykovy university logo_sci ODDĚLENÍ FUNKČNÍ GENOMIKY A PROTEOMIKY Laboratoř analýzy biologicky významných komplexů Centrální laboratoř CL Laboratoř molekulární fyziologie rostlin logo laboratoře Logo1me LOGO CENTRÁLNÍ LABORATOŘ • přístup k pokročilým technologiím na bázi sdílené instrumentace a její kvalifikované obsluhy proteomické techniky genomické techniky • výuka - přednášky a praktické kurzy • členství v ABRF (Association of Biomolecular Resource Facilities) TECHNIKY V CENTRÁLNÍ LABORATOŘI • sekvenování a fragmentační analýza DNA • syntéza a purifikace oligonukleotidů • kapalinová chromatografie • gelová elektroforéza • analýza obrazu • digesce proteinů • hmotnostní spektrometrie • minisklad reagencií pro molekulární biologii SYNTETICKÉ OLIGONUKLEOTIDY • definice • aplikace • modifikace • syntéza • purifikace • kontrola kvality • design sekvence • zásady navrhování • software OLIGO 7 • praktická ukázka oligonukleotid • krátká jednořetězcová struktura • DNA nebo RNA (event. PNA) • hydroxyl na obou koncích (normálně na 5´- konci fosfát) • oligonukleotid syntetický oligonukleotid primer orientace! polymeráza! Aplikace syntetických oligonukleotidů • konstrukce duplexů • primery pro syntézu komplementární DNA PCR, Real-Time PCR • hybridizační sondy pro klonování • místně cílená mutageneza • strukturální rentgenová analýza NA • NMR studia interakcí DNA-protein • potenciální léčiva • gene arrays Modifikace • degenerace • konce řetězce • báze • fosfát • cukr • PNA Degenerované oligonukleotidy M A or C R A or G W A or T S C or G Y C or T K G or T V A or C or G H A or C or T D A or G or T B C or G or T N G or A or T or C X G or A or T or C 2-deoxyinosin ? univerzální báze: 3-nitropyrrol ? 5-nitroindol ? www.glenres.com Degenerované oligonukleotidy Příklady: ACG TAC GTA CGT ACG TAC nedegenerovaný ACG TAM GTA CGT ACG TAC M = A/C ACG TAC GTA CDT ACG TAC D = A/G/T ACG TAC GTA CGT ACG NAC N = A/C/G/T Modifikace na 5´- konci sekvenování fragmentační analýza gene arrays Real-Time PCR postsyntetické modifikace Modifikace na 3´- konci derivatizovaná matrice Real-Time PCR • 2x značená sonda • REPORTER • QUENCHER Další modifikace páteř cukr Terapeutika nedegradována nukleázami! modifikace fosfodiesterové vazby ANTISENSE oligonukleotid • • oligonukleotid nebo analog • komplementární k segmentu RNA nebo DNA • vazbou inhibuje jejich normální funkci Peptidonukleová kyselina N-(2-aminoethyl)-glycin N-terminal C-terminal 5´-end 3´-end • nenabitá molekula • vazba k DNA/RNA PNA DNA PNA Peptidonukleová kyselina N-(2-aminoethyl)-glycin • nenabitá molekula • vazba k DNA/RNA PNA DNA PNA Vlastnosti PNA Locked Nucleic Acid 2'-O, 4'-C methylenový můstek potlačená flexibilita ribofuranózového kruhu struktura je zamčena do rigidní C3-endo konformace zlepšená hybridizace výjímečná biostabilita LNA Bz-A-LNA 5-Me-Bz-C-LNA dmf-G-LNA T-LNA p10-2000 p10-2011 p10-2029 p10-2030 Syntéza oligonukleotidu • organická syntéza na pevné fázi • od 3´-konce k 5´-konci • bezvodé prostředí OLIGONUKLEOTIDY design syntéza purifikace EXPEDITE 8909 New Campus_07 Kontrola kvality BioCADlab • anex • RP HPLC Perfúzní chromatografie 2chrom Perfúzní chromatografie POROS klasický sorbent POROS Maldi-Tof MS CE Reflex%20IV PAGE New Campus_28 New Campus_31 Textové pole: PURIFIKACE Sephadex RP cartridge HPLC PURIFIKACE Odsolování Chroma4 • soli • oligonukleotid • OBJEDNÁVKY www.sci.muni.cz/FGP • on-line • e-mail • písemně corel-obr002 DESIGN OLIGONUKLEOTIDU • manuální • počítačový Hlavní kritéria pro sekvenci PCR primeru • vysoce specifické • netvoří dimery a vlásenky • stabilní duplexy s aktivní sekvencí • nepříliš stabilní 3´-konec www.protocol-online.org/prot/Research_Tools/Online_Tools/Oligo_Design/index.html oligo OLIGO 6 OLIGO 7 (od roku 2008) • PCR primery, • hybridizační sondy • sekvenační primery • • • TaqMan sondy • primery pro nested PCR • molecular beacons • siRNA • • 5´ 3´ 5´ 3´ 5´ 5´ UPPER - FORWARD - LEFT LOWER - REVERSE - RIGHT - + sequence-window-5 Terminologie PCR primerů forward primer… část sekvence + vlákna reverse primer… část sekvence - vlákna 5´ 3´ 5´ 3´ 5´ 5´ UPPER - FORWARD - LEFT LOWER - REVERSE - RIGHT - + sequence-window-5 Terminologie forward primer… část sekvence + vlákna reverse primer… část sekvence - vlákna polymeráza polymeráza 5´ 3´ 5´ 3´ 5´ 5´ UPPER - FORWARD - LEFT LOWER - REVERSE - RIGHT - + sequence-window-5 Nasedání PCR primerů • 1 ATGGCTTCTG CTCAATCTTT CTACAACCAA AGCTCTGTCT TGAAAATCAA 51 TGTCATGGTT GTGGACGATG ATCATGTTTT CCTTGATATC ATGTCACGCA 101 TGCTTCAACA CTCCAAATAC AGAGGTAATT AAATATTATT ATCATATTAT 151 ATATAATATG TTATTGATTT TTTGTTTGTG ATTTCATTTA GATTTTTATT 201 TCTATGATTT CTTAGCATGA AATACAATTT TTGGAGAAAC AACTAGCAGT 251 TTTAAAAACA AAACTTGAAT TTTGAGAAAT TCAAAGATGT TATATATATA 301 TGTCAAAATT TAACAATTAT TCTTCTAAAT CATCCGGATT CCGTTTACAT 351 GTACACATCT ACAATTTTCA ATTGAGGTAT TCTTGTTTTG ATGCCTTTGA 401 GACGAATAGT TTGATTGATA AAAAAAATTC TAACCAATAT GATATATAAA 451 GTTTATTTTC TTTTTGTCAA ACCATACTTT ATACTATGTA ACTTTTTTAA 501 GAGATTATTG AAAATAGTTT ATTTATAAAA TAGTAACCTA TTGTTGAATT 551 AAAAAAAAAA AAAAAATTGT AAATCGTGTT TGCAAACGAC ATGTGATTTA 601 TCTTAGTTTA AAACTAGCTG ATATTCTTCA AATCGACTGT TCTTATAAGT 651 AATCAACCAA TTAGCATCAA TCACAATAAA TTGTAAACAC TTCAATGAAA 701 ATGGTGATTT TAAAGAATAT GTTTTACTTA TGTTATGAAC TATCTCAAAT 751 TTGTGAAATA TTTCATAACT AATGTGGAAA ACTATATAAC CCCTCCATAC 801 AAAACGTAAG TAAAATTTAT GAAATCCTAT CATTTTTAAA GGTTAAACCA 851 ATCAAAAAGT AATAATTCTT GGTACTTGCA ATATTTTTGT CATTATATTT 901 TAGTTTATTA ATTTTATTTT GATTAAATGG TTTTAGATCC ATCAGTTATG 951 GAGATCGCAG TTATAGCTGT AGACGATCCG AAGAAAGCAT TATCTACTCT 1001 AAAAATTCAA CGAGACAATA TAGATCTCAT AATCACAGAT TATTATATGC 1051 CTGGTATGAA CGGTTTACAA CTCAAAAAAC AAATCACTCA GGAATTTGGA 1101 AATTTACCGG TCTTAGGTAA CATTTTTTGT TCTTTACAAC TTAAATTAAA 3´ • + 5´ CTT CTG CTC AAT CTT TCT AC 3´ FORWARD 5´ TGA AGA ATA TCA GCT AGT TT 3´ REVERSE 5´ sequence-window-1 sequence-window-2 sequence-window-4 sequence-window-5 sequence-window-6 search options available subsearches PCR window primers key info Priming Efficiency PE duplex formation graph • DIMER intermolekulární • HAIRPIN intramolekulární DUPLEXY hairpins window false priming sites of M13 false priming sites of M13 database window restriction enzyme search result false priming sites of M13 DNA concentration calculator • …nejlepším učitelem je praxe… • •