1. úloha. Pulzní aelová elektroforéza aenomové DNA bakterií Pulzní elektroforéza je elektroforetická metoda umožňující na rozdíl od klasické elektroforézy efektivní dělení molekul DNA větších než 50 kb (až do velikosti několika Mb). Při pulzní elektroforéze se periodicky mění orientace elektrického pole. Při působení elektrického pole se molekuly DNA prodlužují a zarovnávají ve směru elektrického pole a migrují směrem k anodě. Bylo zjištěno, že po odstranění elektrického pole se prodloužená molekula DNA vrací nazpět do relaxovaného stavu. Doba této relaxace závisí na délce molekuly. Periodické změny orientace elektrického pole způsobují relaxaci a opěrné prodlužování a zarovnávání molekul podle orientace nového pole. Princip pulzní elektroforézy je následující: Při působení prvního pole se molekula zarovná ve směru tohoto pole a začne migrovat v gelu. První pole je odstraněno a začne působit druhé pole. DNA musí změnik konformaci a reorientovat se než začne migrovat v druhém el. poli. Čas nutný pro tuto reorientaci (reorientační čas) je velmi citlivý na velikosti molekuly. Větším molekulám trvá reorientace déle než menším. Zatímco větší molekuly se ještě reorientují, menší už mohou začít migrovat gelem. Jestliže doby působení obou střídajících se polí jsou stejné, DNA migruje rovně gelem cik-cak způsobem. Používané termíny: Switch interval (pulzní čas) - doba po kterou je každé ze střídajících se elektrických polí aktivní. Reorientační úhel: úhel mezi dvěma střídajícími se poli. Inverzní pole - Uspořádání pulzní elektroforézy, kdy se střídají pole orientovaná v opačném směru (reorientační úhel je 180°). Používané hmotnostní standardy: konkatemery připravené z DNA bakteriofága X mají obvykle 1 - 20 -merů (ladder); konkatemery z ligovaných plazmidů; chromozómy Saccharomyces cerevisiae nebo S.pombe Při příprave vzorků DNA větších než 500 kb je nutné molekuly chránit jak před mechanickým poškozením (působením střižných sil), tak před nukleolytickou degradací během izolace. K tomuto účelu se používá speciální metoda izolace, při které jsou buňky nejprve fixovány v nízkotající agaróze a teprve potom prováděna lyze a purifikace DNA. Princip izolace DNA: Objekt: Kmeny Staphylococcus aureus: Postup: Izolace DNA pro pulzní gelovou elektroforézu (PFGE) 1. 20 ml 2 x YT-media naočkovat bakteriální kulturou (z 18 hod. kultury) a inkubovat při 37 °C do OD600 = 0,2 (ca. 1-2 hodiny na třepačce). 2. Přidat 200 |ll 0,5 M EDTA a kulturu zchladit na 4 °C /10 min. 3. Centrifugovat při 3000 min"1, 4°C, 15 min, centrifuga K23. 4. Dvakrát promýt 2 ml promývacího roztoku zchlazeného na ledě (10 mM Tris.Cl, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA, 1 M NaCl, pH 7,5) a resuspendovat v 200 |ll stejného roztoku. 5. 100 |ll bakteriální suspenze zahřát v mikrozkumavce na 55 °C (2-3 min.), přidat 7 |ll lyzostafinu ze zásobního roztoku 0,5 mg/ml (lyzostafin přidávat pouze k Staphyloococcus) a smíchat se 100 |ll 2% low melting point agarose (roztok v 50 mM Tris.Cl, 5 mM EDTA, pH 8), předem vytemperované na 55 °C. 6. Suspenzi rychle přepipetovat do komůrek tvořítka po 200 |ll a uložit na 20 min. při 4°C. 7. Vzorky přenést do 1 ml lyzačního roztoku (6 mM Tris.Cl, 100 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,5% Brij 58, 0,2% Na-Deoxycholát, 0,5% Laurylsarkosin, pH 7,6), 500 |lg lysozymu (zásobní roztok 50mg/ml), 1 |ig RNasy (zásobní roztok 10 mg/ml). Inkubovat za mírného třepání při 37 °C na vodní lázni 2-3 hod. 8. Lyzační pufr vyměnit za deproteinizační (25 mM EDTA, 20 mM EGTA, 1% laurylsarkosin, pH 9,0) a přidat 500 |lg proteinasy K (zásobní roztok 10 mg/ml). Inkubovat 12 hod. při 55 °C za mírného třepání. 9. 4 - 5 x promýt v 10 ml TE (pH 8,0) při 4 °C. TE pufr vyměňovat po 2 hodinách (za mírného třepání) nebo nechat stát vždy 24 hod. 10. Agarózové vzorky se mohou skladovat 12 měsíců v TE pufru při 4 °C (lx za měsíc vyměnit) nebo delší dobu v 0,5 M EDTA pH 8,0. Reštrikční štěpení velkých fragmentů DNA v agaróze 1. Pro reštrikční štěpení uříznout ca. 1^1x5 mm bloček a přenést do Eppendorf zkumavky. 2. Přidat 10 |ll 10x restrikčního pufru, 85 |ll vody a 5-10 U restriktázy. Inkubovat při požadované teplotě přes noc. Naštěpené vzorky se mohou přímo nanášet na gel. Příprava gelu a nastavení elektroforézy 1. Připravit 1,2% agarózový gel v 1 xTAE pufru 2. Nanést vzorky naštěpené DNA do jamek na gelu a zalít 0,8% low-melting agarózou v lx TAE pufru, vytemperovanou na 45 °C. 3. Optimální podmínky pro rozdělení fragmentů chromozomální DNA (s CHEF-DRII zařízením): Pulzní časy 1 - 90 s, lineární vzestup; Koncentrace agarózy (Lachema) 1,2 %; Teplota 14°C; Napětí 170 V; Doba elektroforézy 28 hod. pro gel délky 14 cm 4. Obarvit gel v roztoku ethidiumbromidu 1 |ig/ml 1-2 hodiny, odbarvit v dest. vodě a fotografovat pod UV světlem 302 nm. Poznámky: 1. 2x YT médium: Trypton ...16g, Yeast-extrakt ...lOg, NaCl ...5g, voda do 1000 ml, pH 7,0. 2. Laurylsarkosin sterilizovat filtrací, ostatní roztoky sterilizovat autoklávováním. Úloha: Izolace spontánních mutant rezistentních ke streptomycínu metodou gradientních ploten Princip: Molekulární podstata spontánních a indukovaných mutací je stejná. Liší se však ve frekvenci. Frekvence spontánních mutací je podstatně nižší. Tím se také liší od fenotypové modifikace, nebot' ta proběhne prakticky současně ve všech buňkách. Spontánní mutace - rezistence k antibiotikům probíhají dvěma způsoby. Bud' se rezistence k antibiotikům vytvářejí postupně v několika stupních (např. u penicilinu) nebo hned v prvním stupni získáme mutanty rezistentní k různým koncentracím antibiotika. Upozornění: očkování provádět ve sterilním prostředí flow-boxu; použitý materiál pečlivě roztřídit a odnést do umývárny. Objekt: Kmeny Staphylococcus aureus citlivé ke streptomycinu: kmeny S.a .8511-A; S.a. 8511-B; S.a. ISP- A; S.a. ISP- B. Postup: První den. 1. Z 18 hod. kultury vyrostlé na MPA agaru, odebrat 5 kliček a důkladně resuspendovat ve 3 ml MPB. Je nutno vyjít z husté bakteriální suspenze (cca 109 buněk/ml), protože frekvence strR mutantů je velmi nízká. 2. Z takto připravené husté kultury provést rozsev ze zředění 10-6, 10-7, 10-8 vždy na 3 plotny s MPA, pro stanovení celkového počtu buněk v cm3 (tj. titr buněk). Kultivace při 37 °C/24 hod. 3. Připravit gradientní plotny (Obr. 1) se streptomycinem o výsledných koncentracích: 10, 50, 100 a 500 |j,g/mL Pro přípravu zásobního roztoku rozpustit 0,5 g krystalického streptomycinu v 5 ml sterilní destilované vody (přidávat do roztavené MPA půdy o teplotě max 55 oC). Obr. 1 4. Provést rozsevy po 0,1 ml na gradientní plotny (vždy 3 plotny od příslušné koncentrace, viz obr. 2) a pečlivě rozetřít hokejkou po celé ploše. Obr. 2 ! i 18 hod kultura S aureus Strs 3* I —- I I-- I I ——- I I I 10 50 100 500 ng/ml streptomycínu 5. Naočkované plotny inkubovat dnem vzhůru při 37 °C /24 hod Druhý den. Jednotlivé kolonie za linií kompaktního nárůstu přenést do mikrozkumavek s 0,5 ml MPB. Přeočkovat na plotny s různými koncentracemi streptomycinu (5, 10, 25, 50, 100 a 500 ng/ml) formou proužků (viz obr. 3). Příprava ploten: Do známého objemu roztaveného MPA a vytemperovaného na max. 55 °C přidat vámi vypočítané množství zásobního roztoku streptomycinu tak, aby bylo dosaženo požadované výsledné koncentrace. Obr. 3. Kompaktní, nárůst 37 °C /24 hod Třetí den. Z výsledků stanovit nejvyšší koncentraci, ke které je kmen rezistentní a určit frekvenci mutací k jednotlivým koncentracím streptomycinu. Výpočet frekvence mutant: F = titr mutant / titr buněk Vypracovat protokol a odevzdat vyučujícímu. Protokol bude obsahovat: Název úlohy; Objekt; Princip metody stručně; Výsledky (titry buněk, titr mutant.. ..Závěr (hodnocení a diskuze o výsledcích). 3. úloha. Fluktuační test na rezistenci ke streptomycínu a stanovení mutační rychlosti Fluktuační test slouží k tomu, abychom bezpečně rozlišili, zda pod vlivem vnějších změněných podmínek došlo k fyziologické adaptaci nebo zda nová vlastnost buněk je výsledkem spontánní mutace. Necháme-li růst paralelně v několika zkumavkách stejné množství inokula bakteriálního kmene např. citlivého ke streptomycínu po několik buněčných generací a pak vysejeme na plotny se streptomycínem, dostaneme výsledky: a) šlo-li o fyziologickou adaptaci (která je možná až ve styku s faktorem, který ji vyvolává) pak se výskyt rezistentních kolonií na jednotlivých plotnách řídí Poissonovou distribucí a s2= x ax2 %2teor Mutační rychlost udává pravděpodobnost, že buňka bude za určitou dobu v určitém znaku mutovat. Udává se např. jako pravděpodobnost na 1 buňku a 1 generaci. Objekt: Staphylococcus aureus HS 1160 Strs, Staphylococcus aureus 8511 Strs, Staphylococcus aureus ISP8 Strs Úkol: Dokažte, zda vzniklá rezistence ke streptomycínu je výsledkem spontánní mutace nebo fyziologické adaptace. V případě, že se jedná o spontánní mutaci, stanovte mutační rychlost. Schéma postupu: ^ 10mlMPB \ 18 hod. kultura S. aureus Strs 4 ml KONTROLA I I MPA + 15|ig/ml streptomycínu (zás. roztok streptomycínu 100 mg/ml) 46 ml MPB ÍTTTTTTTTTTTTTTTTTU po 0,5 ml 24 hod. Inkubace při 37 °C a pak vylit celý obsah na plotny 111111111111111 I II-1 MPA + 15 ng/ml streptomycínu Inkubace 24 - 48 hodin při 37 "C 20x výsev na MPA+ 15ng/mlstr. Il=l 3* výsev 0,1 ml ve zředění 10"4 10"5 10"6 Kontrola na MPA bez streptomycínu, titr po inkubaci. 4. úloha. Konjugace kmenů Escherichia coli Hfr a F Konjugace je proces, při kterém je DNA přenášena z donorové buňky do recipientní v důsledku kontaktu buněk a vytvoření konjugačního můstku. Uskutečnění konjugace lze dokázat vznikem rekombinantů, které nemohly vzniknout jinak, než rekombinací mezi genomem donorového a recipientního kmene. Konjugace u E. coli je závislá na přítomnosti a stavu F faktoru. F je plazmid (94,5 kb), který se může autonomně replikovat v buňce nebo integrovat do hostitelského chromozómu. Podle stavu F faktoru se označují příslušné kmeny: Označení Stav F faktoru F- F faktor není přítomen v buňce F+ F faktor je přítomen v cytoplazmě F' F faktor nese segment bakteriálního chromozómu Hfr F faktor je integrován do bakteriálního chromozómu Vlastnosti Vhodný recipient během konjugace. Může být přenášen konjugací do recipientní buňky; přenos chromozomálních genů může zprostředkovat při velmi nízké frekvenci. Může být přenášen spolu s asociovaným bakteriálním segmentem chromozómu; může zprostředkovat přenos chromozomálních genů při střední frekvenci v důsledku integrace do chromozómu v homologických oblastech Může přenášet chromozomální znaky při vysoké frekvenci (od pevného bodu na chromozómu, který je charakteristický pro každý Hfr) Objekt: Donor: Escherichia coli HfrH Reich tre+ leu+ pro+ ade+ thť stť Recipient: Escherichia coli F" 28R801 tre" leu pro" ade" thť stť Do recipientních buněk přechází segment tre+ leu+ pro+ ade+ thť. Marker str zůstává v endogenotu. Postup: 1. Příprava mladých kultur donorového a recipientního kmene: Naočkovat 1 kličku do 20 ml PNS média a inkubovat při 37 °C 18 hodin (do log. fáze růstu). 2. Smíchat kultury donorového a recipientního kmene v poměru 1 : 1 (5 ml + 5 ml) a inkubovat za aerace (při šetrném míchání na vodní lázni) při teplotě 37 °C 3 hodiny. 3. Současně stanovit titr donorového kmene HfrH rozsevem na plotny MPA ve zředění 1(T5, 1(T6, 1(T7, vždy po 3 plotnách. 4. Přesvědčit se, že ani kmen HfrH ani F " nerostou na selektivní půdě. Kontrolu provést výsevem po 0,1 ml kultury zředěné 10"1 na 3 plotny MA + streptomycin 100 |lg/ml + thiamin 5 |lg/ml. Ředění provádět ve fyziologickém roztoku! 5. Po 3 hodinách inkubace vyset neředěnou směs na selektivní půdu po 0,1 a 0,2 ml (vždy po 3 plotnách). 6. Hodnocení pokusu: vyjádřit frekvenci rekombinantů na počet buněk Hfr. Živné půdy: PNS bujón půda pro konjugaci glukóza 1 g Bacto beef extract 1,5 g Yeast extrakt 1,5 g pepton 5 g NaCl 3,5 g K,HP04 3,68 g KH7P04 1,32 g +0 dest. 1000 ml pH 7,2 (upravit 10M NaOH) autoklávovat 20 min. /121 °C MPA masopeptonový agar (kompletní půda) MA minimální agar: složka A 1,5% vodní agar, pH 7,2 složka B (4x koncentrovaný roztok solí) NH Cl 20 g NH NO 4 g Na,SO4" 8 g k,Hpo4 12 g kH2po4 4 g H O dest. 1000 ml MgSO4- 7+O 1,6 ml po autoklávování složka C 20% glukóza - přidat 1ml na 100 ml MA složka D streptomycin - přidat do konečné koncentrace100 |lg/ml ze zásobního roztoku 100 mg/ml složka E thiamin přidat do konečné koncentrace 5 |lg/ml ze zásobního roztoku 50 mg/ml Při přípravě MA smíchat složky B (1 díl) + C + D + E, vytemperovat na 45 °C a smíchat se složkou A (3 díly). Příprava minimálního agaru na konjugaci 2. SLOŽKA A vodní agar 180 ml vytemperovat na 47 °C SLOŽKA B roztok solí vytemperovatna 47 °C 60 ml { SLOŽKA C SLOŽKA D SLOŽKA E glukóza 2,5 ml streptomycín 100 ng/ ml thiamin 5 jag/ ml KONJUGACE Kontrpla na MA + str + thi 10 ředit ve fyziol. rozt. 1 plotna (0,1 ml) Kontrpla na MA + str + thi 10 ředit ve fyziol. rozt. 1 plotna(0,1 ml) E. coli HfrH Reich 5 ml Titr na6LBA 7 10 ,10 ,10 po 3 plotnách (po 0,1 ml) E. coli F- 28R801 5 ml KONJUGACE 37 °C / 3 hod / šetrně třepat I Výsev na MA + str + thi neředěné 3 plotny (0,1 ml) + 3 plotny (0,2 ml)