Molekulární biotechnologie č.10c •Využití poznatků molekulární biotechnologie. Využití škrobu, cukrů a celulózy. Využití molekulární biotechnologie – v mnoha oblastech •Molekulární diagnostika •Bioremediace a využití biomasy •Využití škrobu a sacharidů, utilizace celulózy •Mikrobiální insekticidy •Baktérie stimulující růst rostlin •Vakcíny a terapeutické proteiny. •Příprava a využití transgenních rostlin. Nové potraviny. •Příprava a využití transgenních zvířat. •Genová terapie lidských somatických buněk. • • Využití škrobu, cukrů a celulózy •Zejména v potravinářském průmyslu •Škrob je hydrolyzován na komponenty o nízké molekulové hmotnosti a nakonec je přeměňován na fruktózu a alkohol • Průmyslová produkce fruktózy a alkoholu •Využívá enzym alfa-amyláza z Bacillus amyloliquefaciens a • glukoamyláza z houby Aspergillus niger • • Průmyslová výroba fruktózy a alkoholu ze škrobu (Glick a spol.2003) Techniky genového inženýrství se využívají •S cílem snížit náklady na výrobu obou enzymů •A tím i snížit cenu alkoholu při průmyslové produkci alkoholu z cukru • Rozdíly ve fermentaci tekutého škrobu u různých kvasinek (Glick a spol. 2003) Genové manipulace •Jsou prováděné s cílem zvýšit produkci glukózo isomerázy •Thermus thermophilus produkuje xyloso/glukoso isomerázu, která je aktivní a stabilní při vysokých teplotách, ale je produkována v malých množstvích •Gen byl izolován, klonován v plasmidu a exprimován v E. coli a Bacillus brevis •Pod kontrolou různých promotorů a rbs •Bylo docíleno vysoké produkce pro průmyslové využití Vysoká produkce enzymu v různých baktériích (Glick a spol. 2003) Cílená mutagenese byla prováděna •S cílem zvýšit substrátovou specificitu • Zvýšení katalytické účinnosti xyloso/glukoso isomerázy (Glick a spol. 2003) K průmyslovým fermentacím při výrobě ethanolu • •Jsou většinou používány kvasinky •Ale také G- baktérie Zymomonas mobilis •Tyto baktérie fermentují glukosu, fruktozu a sacharozu a produkují relativně vysoké množství alkoholu rychleji než S. cerevisiae •Proto je studiu této baktérie věnována pozornost • Produkce alkoholu - srovnání Utilizace celulózy (lignocelulózy) •Celulóza je nejodolnější biopolymer v biosféře (nerozpustný, odolný vůči hydrolýze) Jedná se o •1) primární celulózový materiál z užitkových rostlin (bavlna, stavební dřevo, odpadní materiál ze stromů při těžbě dřeva) •2) odpady rostlinné výroby – sláma, seno, plevy, rýžové plevy, stvoly cukrové třtiny, dřevní piliny, hobliny •3) městská odpadní celulóza – celulóza z odpadního papíru Obvyklé složení lignocelulózy Celulóza •Může být hydrolyzována na glukózu, avšak ta musí být uvolněna z komplexu tvořeného ligninem a hemicelulózou • Hydrolýza celulózy • vyžaduje působení silné kyseliny nebo zásady, použití vysoké teploty a tlaku, • což je neekonomické • Jsou hledány cesty •Pro účinnou biotechnologickou degradaci celulózy • Izolace celulolytických genů •z přírody •z baktérií •hub •rostlin • • Celulázová aktivita •Představuje souhrnnou aktivitu více enzymů, které se nacházejí na povrchu buňky: •Endoglukanáza – štěpí celulózu uprostřed •Exoglukanáza – štěpí naštěpený celulózový řetězec na celobiózu, celotriózu a na glukózu •U hub celobiohydroláza – exoglukanáza, která odštěpuje 10 nebo více glukózových zbytků •Beta-glukozidáza – přeměňuje celobiózu a celotriózu na glukózu • . •. Manipulace s celulázovými geny •S cílem vytvořit organismy s účinnější celulázovou aktivitou •Prokaryotické celulázové geny byly izolovány z genomových bank konstruovaných v E.coli z mnoha bakteriálních rodů (Clostridium, Streptomyces, Ruminococcus, Cellulomonas, Fibrobacter, Bacillus, Cellvibrio, Pseudomonas) •A z hub a rostlin (! sekvence eukaryotických genů je odlišná i když funkce je stejná) Příklad manipulace s celulolytickými geny •Geny pro endoglukanázu a exoglukanázu byly izolovány z bakteriálních buněk Cellulomonas fimi •vloženy do plasmidu pod kontrolu promotoru S. cerevisiae a •transformovány a exprimovány v buňkách S. cerevisiae • Transformanty • degradovaly celulózu filtračního papíru a dřevních pilin (hoblin) •Rychlost hydrolýzy byla zvýšena přídavkem beta-glukozidázy, čímž se snížilo množství celobiózy a zpětná inhibice endo- a exoglukonázy • Využití celulázových enzymů •V průmyslové biokonverzi odpadního papíru na alkohol •Odpadní papír byl natráven přídavkem celulolytických enzymů při 45ºC •Uvolněná glukóza byla fermentována S. cerevisiae při 37ºC •Bylo získáno 400 l ethanolu/ 1t odpadního papíru. •Lze tak šetřit spotřebu benzínu a ropy. Isolace eukaryotických celulázových genů (Glick a spol. 2003) s využitím diferenciální hybridisace Produkce buněčného proteinu •SCP, single cell protein SCP •označuje mikrobiální buňky narostlé v kultuře či veškeré proteiny extrahované z čistých buněčných kultur •Proteiny jsou používány jako potravinový (krmivový) doplněk lidského (živočišného) proteinu (food-grade, feed-grade) • • Mikroorganismy •obsahují velké množství proteinů – 60-80% suché váhy, vysoké hladiny methioninu, lysinu, vitaminů a esenciálních minerálů •Nevýhody: vysoký obsah NK, pomalé trávení (alergie), potenciální přítomnost toxických komponent (těžké kovy, mykotoxiny) •SCP je dražší než jiné zdroje proteinů např. soja • • Mikroorganismy použité pro produkci SCP •Sacharomyces cerevisiae (kvasinka)– melasa zdroj C, amonné soli zdroj N (1. světová válka, pro zvýšení výživné hodnoty polévek a omáček) •Kluyveromyces fragilis (kvasinka) – syrovátka •Candida lipolytica (kvasinka) – ropa, rafinérské výrobky (alkany) (cena ropy dnes vysoká) •Chaetomium cellulolyticum (houba) – buničina, celulóza •Methylophilus methylotrophus (baktérie) – methan, methanol •A další Tabulka Největší kontinuální fermentor na světě pro komerční produkci SCP •50 000 t SCP/rok (firma Imperial Chemistry Industry) •Methylophilus methylotrophus •Produkce od r. 1987 neekonomická • Dnes SCP •Pomocí genově modifikovaných organismů •Nadějná je produkce SCP jako vedlejšího produktu likvidace odpadů •Musí být ekonomické