Fyziologie kmenových buněk Jiří Pacherník E-mail: jipa@sci.muni.cz Tel: 532 146 223 / 116 Podpořeno FRVŠ 540/2007 Dělení buněk (proliferace) Symetricky - vznikají dvě identické buňky Asymetricky - jedna si zachovává původní fenotyp, druhá je již jiná Diferenciační dělení -obě nově vzniklé buňky mají i nový fenotym, jsou dalším stupněm v dané diferenciační linii diferenciační dělením symetrické diferenciační dělením asymetrické Diferenciace (rozrůzňování) buněk Buňky mění svůj fenotyp v na základě změny exprese svého genotypu v důsledku vnějších signálů. Regulace diferenciace je často provázána s proliferací (epigenetické změny v jádře během mitotického cyklu?). Kmenová buňka aktuální <-> potencionální * Často proliferují a mají schopnost krátkodobé sebeobnovy. ** Post-mitotické buňky = už se nikdy nedělí. Ne všechny terminálně diferencované buňky jsou post-mitotické. Diferenciace buněk přestavba genomu / chromatinu -> exprese jiného paternu genů -> jiná morfologie, jiné funkce a potenciál Determinace - předurčení pro danou diferenciační linii / dráhu geny a jejich produkty - „houskeeping" (metabolismus, transkripce / translace, základy cytoskeletu) - všeobecně abundantní (transripce/translace, cytoskelet, komponenty signálních drah) - specifické (enzymy, specifické transkripční faktory, cytoskelet - komponenty intermediálních filament, s cytoskeletem asociované proteiny) Z hlediska schopnosti tvořit další buněčné typy se buňky dělí na: Totipotentní - mohou z nich vznikat všechny buňky daného živočišného druhu Pluripotentní - mohou dát vznik všem buňkám budoucího jedince (všechny tři zárodečné listy) Multipotentni - muže z nich vznikat vetší počet bunečných typu dané bunečné řady (Oligopotentní - podobné jako multipotentní, ale méne typU) Unipotentní - dávají vznik jen dvema typUm bunek Nullipotentní - mohou se pouze delit, nemení fenotyp totipotentní buňky pluripotentní, multipotentní, .... buňky Totipotentní buňky -1-až8-buněčné embryo (= Embryonální nespecifikované - pouze savci) - Omezené možnosti dělení (neprobíhá transkripce; myš 2/4 b., člověk 8 b.) - Existují pouze přechodně 2-cell stage Ztráta totipotence v průběhu časné embryogenéze - vznik nerovnoměrných podmínek pro růst buněk - tento proces je ireverzibilní Tha'Cfíí|]ľi(]l)ľm[will h«romť part or ihc pl-atenlii. http://biology.kenyon.edu/courses/biol114/Chap13/Chapter_13.html#fertilization Děleni buněk 2-bunecneho embrya, určeni polarity a její vliv na dalsi osud blastomer Magdalena Zernicka-Goetz 2006 ME ,-, # • EM $ • O C MM & EE RANDOM 80% of all embryos M - meridiální / E - ekvatoriální Orientace blastomer 4-buněčného embrya a její vliv na zachováni absolutni totipotence těchto buněk Pluripotentní buňky (savci) a) In vivo: buňky vnitřní buněčné masy buňky epiblastu / primitivního ektodermu buňky nerální lišty (4tý zárodečný list) kmenové buňky teratomů (?) ! (somatické kmenové buňky?) b) In vitro: embryonální kmenové buňky embryonální zárodečné buňky embryonální nádorové buňky (kmenové buňky teratomů) ! (somatické kmenové buňky?) Morula Blastocyst Late blastocyst Egg cylinder Gast rul a Fetoplacental cone Visceral endoderm ectoderm Boiani & Scholer 2005 Kmenové buňky mohou být pluripotentní, multipotentní,... ale pluripotentní nebo multipotentní buňky nemusí být kmenové. Pleopotence (změna v determinaci) pluripotentní buňka \ multipotentní tkáňově specifická buňka Pleopotence multipotentní tkáňově specifická buňka (Pleopotentní buňka) (Ji) / \ * progenitory 1 I o • • terminálně diferencované buňky KMENOVÉ BUŇKY Schopnost sebeobnovy = self-renewal Schopnost dávat vznik jiným typům buněk = pluripotence / multipotence /..... = > kmenovost = stemness - Společné znaky s embryonálními a nádorovými buňkami, nezralý fenotyp / relativně nediferencované (= dlouhé telomery / vysoká aktivita telomeráz, specifické proteinové markery, velký jádro / plasmový poměr,...) = VYHRAZENÉ (PROFESIONÁLNI) KMENOVÉ BUŇKY -Některé somatické, terminálne diferencované buňky si zachovávají schopnost sebeobnovy a v případě potřeby i multipotence, normálně jsou ale quiescentní (spící) = FAKULTATIVNÍ KMENOVÉ BUŇKY -Některé diferencované buňky si také dlouhodobě zachovávají schopnost proliferace, sebeobnovování a podílejí se tak na udržení homeostáze v tkáni = Sebeobnovující se diferencované buňky KMENOVÉ BUŇKY PRIMÁRNÍ = existují „in vivo" - dávají vznik buňkám dané bunečné struktury / tkáne / orgánu / (organismu) - relativne pomalá proliferace - jsou nejčasteji multipotentní, snad nekteré i pluripotentní či unipotentní - jsou základním zdrojem bunek pro regeneraci organismu a homeostázi - mají schopnost sebeobnovy (self-renewal) = in vivo asymetrické delení -s vekem jich ubývá, ale pravdepodobne nikdy behem života jedince úplne nevymizí profesionální SC - v tkáni jsou lokalizovány ve specifické oblasti, „niche" (koutek) - mají společné znaky s embryonálními a nádorovými buňkami = dlouhé telomery, specifické proteinové markery, velký jádro / plasmový pomer,... - ??? Somatické kmenové buňky (embryonální a adultní) Buňky některých zárodečných linií (neurální lišta) a kmenové buňky trofoblastu KMENOVÉ BUŇKY ODVOZENÉ/SEKUNDÁRNÍ = existují jen „in vitro" jsou připravené z populací pluripotentních embryonálních buněk, ze zárodečných buněk, nebo z progenitorů embryonálních a dospělých tkání relativně rychle proliferují některé jsou multipotentní (z embryonálních a dospělých tkání), některé pluripotentní (embryonální původ) mohou být zdrojem buněk pro regeneraci organismu mají schopnost sebeobnovy (self-renewal) = „asymetrické/symetrické" dělení mají společné znaky s embryonálními a nádorovými buňkami = dlouhé telomery, specifické proteinové markery, velký jádro / plasmový poměr,... ??? Embryonální kmenové buňky -> odvozené z vnitřní buněčné masy (Kmenové buňky epiblastu) Embryonální zárodečné buňky -> odvozené z primordiálních zárodečných buněk Embryonální nádorové buňky -> odvozené z kmenových buněk teratomů Somatické kmenové buňky odvozené -> odvozené ze somatických kmenových buněk Vybrané signální dráhy Signální dráha LIF (leukemii inhibující faktor) -> gp130 signalling Evolučně se zdá, že tato dráha hraje důležitou úlohu v regulaci pluripotentních a snad i multipotentních buněk u živočichů obecně (prokázáno i u Drosophilý) Význam gp130 signalizace v průběhu embryogeneze Signální dráha FGFs (Fibroblastové růstové faktory) Signální dráha TGFp / BMPs (Transformující růstový (growth) faktor p kostní (bone) morfogenetické proteiny) TCF|ľ CROSSTALK FGF & TGFp DRÁHY TRANSDUKCE SIGNÁLU Potlačení sérového BMP přidaným FGF-2 => inhibice diferenciace hES FGR IGF EGF, HGF > Ras > MEK1 Erk1p2 MH1 Smadl Other kinases BMP receptor MH2 I® Nuclear import MH1 Smad2 Epidermal differentiation Mesoderm ventralizaton Massague, 2003 TGFß, Nodal Activin receptors MH2 Nuclear mport Mesoderm induction Signální dráha Wnts http://www.stanford.edu/~rnusse/wntwindow.html genes Signální dráha Hedgehog sonic hedgehog (Shh), Indian hedgehog (Ihh) Ptc - Patched Smo - Smoothened Intracellular vesicle Sufu Iguana Signální dráha Notch Brennan 2003 a) klasická dráha signální transdukce Notch, po navázání ligandu (DSL rodina = Delta, Serrate, Lag-2; Jagged) dojde k odštěpení extracelulární části receptoru a následně i intracelulární (NICD - Notch intacellular domain), ta translokuje do jádra a v dimeru s CSL (= CBF1 - Cp binding factor 1) aktivuje transkripci. b) dráha snad aktivovaná dosud neznámým faktorem, kdy dochází k aktivaci proteinu Deltax, který pak inhibuje JNK a CBP/p300 aktivitu. Signální dráha jaderných receptoru obecně hormone o LED 3 NR/HSP complex cytoplasm HSP NR dimer NR/normone complex coacüvaior RNA polymerase MR dimer nuclear DNA HRE nucäear □ore mRNA target gene changed cell function mRNA protein J ri boso me nuclear envelope cell membrane Boghog 2; Wikipedia Signální dráha jaderných receptoru NR ) jaderné (nuclear) receptory transkripční faktory TF transkripce transkripce DNA DNA sebeobnova x diferenciace ?differenciace x sebeobnova? Pluripotentní, odvozené kmenové buňky Embryonální kmenové buňky (Embryonic stem cell - ESC) Embryonální zárodečné buňky (Embryonic germ cell - EGC) Embryonální nádorové buňky (Embryonal carcinoma cell - ECC) Kmenové buňky epiblastu (Epiblast stem cell - EpiSC) Early-primitive ectoderm-like - EPL Embryonální kmenové buňky (Embryonic stem cell) ESC Illustration by Cell Imaging Core of the Center for Reproductive Sciences. -jsou odvozené z vnitřní buněčné masy blastocysty - fenotypem odpovídají přibližně buňkám vnitřní buněčné masy (mESC, ICM - inner cell mass) nebo epiblastu (hESC, EpiSC) - jsou pluripotentní - přirozeně neexistují, pouze in vitro - jsou nesmrtelné - mají schopnost si udržet stabilní genotyp (!?) - po injikaci do imunitně tolerantního organismu tvoří teratomy (důkaz pluripotence) - po injikaci do blastocysty mají schopnost tvořit kompletní chiméry (známo jen u mESC, důkaz pluripotence) Ontogeneze a diferenciační potenciál buněk vnitřní buněčné masy Embryonální tkáně Zárodečný ektoderra Zárodečný epiblast Zárodečný mezoderm Primitivní proužek ^ Alaníoický ektoderm Zárodečný entodenii Extraembryonáini entoderm Zlomkový vak K Cytotrofoblast >- Syneytíotrofobíast Extracmbiyonální tkánč Gilbert 1997 / Bílek 2004 Linie ES buněk na feederu MEF Upraveno podle Kroupová 2004 Homogenní populace ES buněk TERATOM Nádor, který obsahuje buňky více jak jednoho zárodečného listu, vetšinou všech tří. Tyto buňky mohou být fenotypu od časných stádií až po terminálne diferencované Teratomy jsou typické nádory původem ze zárodečných bunek (ovariální a testikulární teratomy. Teratomy jsou jak benigní, tak maligní (teratokarcinom) Kmenové buňky teratokarcinomu = embryonální (Embryonal carcinoma (EC) cells) nádorové CHIMÉRA Organismus je smesí geneticky odlišných bunek / tkání / orgánů Chimeričtí jedinci vzniklí injikací ES buněk (dárce) do blastocysty (příjemce) jsou směsí geneticky odlišných buněk na úrovni všech tkání, a tak také vytváří pohlavní buňky s genotypem jak dárce, tak příjemce! Růst a kultivace ES buněk PROLIFERACE - DIFERENCIACE - APOTÓSA Existence a charakter ES buněk je udržován kombinací účinků vnějších (extrinsic) a vnitřních (intrinsic) faktorů. Vnější faktory si ES buňky částečně syntetizují samy, ale ve větší míře musí být dodávány. Významným zdrojem těchto faktorů je výživná vrstva na které se ES buňky kultivují = FEEDER. Vnitřní faktory si ES buňky nesou jako pozůstatek svého embryonálního původu. FEEDER - výživná vrstva = zdroj růstových faktorů (cytokiny, ECM, ..) a vhodný podklad - nejčastěji se používají myší embryonální fibroblasty (13d p.c., MEF (PEF)) - bez „feederu" z MEF = definované podmínky, ale horší ES buňky - tendence používat druhově identické MEF = sníženi rizika přenosu virů, ... - MEF lze nahradit i jinými typy fibroblastů případně jinými buňkami -MEF lze částečně nahradit komponenty ECM, specifickými cytokiny a přídavky, matrigelem,..., obecně definovanějšími preparáty Důležitou komponentou kultivačního média pro ES jsou také nedefinované faktory séra, které lze nahradit dodáváním specifických růstových faktorů. Často se také používá tzv. Serum-replacement = lépe definovaná náhražka séra (patentované složení). Obecný model inhibice diferenciace ES buněk - ES buňky spontáně diferencují, v kultuře je třeba této diferenciaci zabránit - diferenciace je často spojena s apoptózou - vhodnými kultivačními podmínkami, lze diferenciaci inhibovat - faktory inhibující diferenciaci ES buněk se částečně liší u různých druhů, ale existují výjimky i v rámci jednoho druhu! Model inhibice diferenciace myších ES buněk - existují i linie mES buněk nezávislé na LIF - zdá se, že z LIF závislé linie, lze vyselektovat LIF nezávislou (!?) -mES buňky pěstované bez „feederu" ztrácí schopnost tvořit chiméry in vivo -některé linie nelze bez „feederu" pěstovat vůbec ^vlastnosti mES buněk jsou ovlivněny genotypem imbredního kmene myší z kterého byly izolovány! LIF -leukemiainhibitory factor BMP-2,4,12 bone morphogenetic protein 2,4,12 FCS - fetal calf serum FGF-4 - fibroblast growth factor SR - serum replacement *ABSOLUTNÍ OPTIMUM Model inhibice diferenciace lidských ES buněk MEF (feeder) nebo matrigel FCS - obsahuje jak difereciaci indukující, tak diferenciaci inhibující faktory. Kvalitu FCS také ovlivňuje titr protilátek a složek koplementu. FCS se liší mezi jednotlivými šaržemi = je třeba je testovat. Lépe je používat náhrady FCS se sníženou koncentrací negativně působících látek na kultivaci ES buněk, např. Serum-Replacement ( fy. Invitrogene-Gibco) OPTIMUM??? Vnitřní faktory charakterizující / regulující ES buňky (pluripotentní embryonální buňky) Oct-4 (Oct-3/4, Oct-3, Pou5f1 - master of pluripotency) - transkripční faktor, homeoprotein - exprimuje se již u 2/4 (myš - aktivace transkripce) buněčného embrya - ve stádiu blastuly je jeho exprese výrazně zvýšena - ve stádiu blastocysty je pouze v buňkách ICM - později jeho exprese vymizí, zachovává se pouze v PGC (a později v zárodečných buňkách), nízká exprese se předpokládá i v somatických kmenových buňkách ?!? - nebyl nalezen u kuřat - reguluje expresi FGF-4 (Oct-4/Sox-2), PDGFa, .... -v průběhu diferenciace za snížení jeho exprese odpovídá GCNF( germ cell nuclear factor, RA (retinoic acid),... - V primitivním ektodermu je exprese Oct-4 podporována LRH-1 (liver receptor homologue 1) Nanog - transkripční faktor, homeoprotein - jeho exprese vede k udržení vysoké hladiny Oct-4 - objevuje se již ve vnitřních buňkách moruly Sox-2 - Transkripční faktor Sry-rodiny (sex-determining region Y protein) - Kooperuje s Oct-4 na vlastní expresi -V průběhu indukce neurální diferenciace se jeho exprese zvyšuje Integrin Trophectoderrn ES Primitive endoderm Boiani & Scholer 2005 Potencionální mechanismus účinků LIF u mES buněk LIF/gp130/LIFR Jak2/STAT3 Klf4 A Sox2 A PI3K/Akt + Erk I Tbx3 H I Nanog {} Oct4 Niwa 2009 + alternativní kultivace mES -protocol2i/LIF (A. Smith laboratory) + LF + PD0325901 (inhibice Erk signalizace) + CHIR99021 (inhibice GSK3, Wnt signalizace) Regulace transkripce faktory Oct-4, Nanog a Sox-2 Předpokládaný model vzájemné regulace exprese FoxD3, Nanog a Oct-4 u mES. FOxD3 není exprimován u hES. Vzájemná regulace Oct-4 a Nanog není dosud plně objasněna. Je však již jasné, že Oct-4 řídí transkripci Nanog přímou vazbou v jeho promotoru (společně se Sox-2), jak u mES tak hES. Pro self-renewal ES buněk je klíčové zachovat rovnováhu v hladinách Oct-4 a Nanog (viz. výše). Promotorové sekvence rozpoznávané Oct-4, Nanog a Sox-2 u hES. Model vzájemné regulace Oct-4, Nanog a Sox-2 a některé jimi řízené geny u hES. (^^Proteiny^^) Promotory genů Boyer2005 Ztráta pluripotence u ES bunek v důsledku deregulace rovnováhy mezi hladinou Oct-4 a Nanog Trophectoderm Chamber, 2004 I CM ICM Morula Early blastocyst Inner cell mass Tfopheeloderm Oct4 Sůk2 Late blastocyst Epiblast 6.5 dpc Epiblasf Oct4 Primitive ectoderm GCNF Sůk2 LRH-1 maintains Oct4) I xtraemiiryonic ervdoderrn Mesoderm Endoderm Ectoderm * Na nog expressed in a small suPset of posterior primitive ectoderm cells Johnson 2006 >■■■:■■:■. ■■■■ ES BUŇKY a) myší ES (mES) (LIF/gp130*/STAT3 dependent) x b) lidské ES (hES) (LIF / gp130* / STAT3 independent) Toto rozdělení je pravděpodobně dáno možností některých živočišných druhů mít skrytou březost ve stádiu blastocysty (embryonální diapauza). 1 I II 1 IJMTI 77NodalíTCF(Í FGF t/TGF JJ /other STAT SA1AI > i-\vr NANOG I líl- Ort SO* \ Other Feedback J 0 larget genes Fosď>3/ftes-> STAT3 ve vztahu k pluripotentním buňkám u člověka a myši mESC PGC (h/m) EGC (h/m) embryonální diapauza (myš / lasicovití)Á k hESC/mEpiSC gp13Q signalling \ dependent somatické SC ?? pluripotent multipotent a méně Zygotic General Gene Genomic Activation OftittoyWo" rozdíl s mES - netvoří kompletní chiméry - nebyla detekována aktivní alkalická fosfatáza (AP) (mES, hES, EC, EG, PGC, mají aktivní AP) -EpiSC částečně vysvětlují rozdíly mezi mES a hES Kmenové buňky epiblastu - EpiSC (Epiblast stem cell) Brons, 2007 & Tesar, 2007 Kmenové buňky epiblastu - EpiSC (Epiblast stem cell) Brons, 2007 & Tesar, 2007 c Global gene expression correlation EpiSC no. 1 EpiSC no. 2 0.8S5 0.971 0.974 0.784 mESC no. 1 mESC no. 2 '> 73 m o =! _J "a ~' C" c- □ O C' □ Q "Z' -.. C' C' C" C" l-"1 — rn □■■□(] "r Z Z ZŕSSJEfDH-.llíT SS^i^í < * r n.n ftrn _r _r -r -r .Tut.^ '-"'"-^m 1 r-i.-i.i.n ,-.j.-..n ■íTli". III Cancer tall Unes □ ifl0rciitiat»d Somali z? Is_ Human Embryonic 5C Bibikova, 2006 cancer cells differ, cell SSC hES DAP TIFlfj DAPI/TIF10 □ □ □ n * # ■ • ■ # * Změny v distribuci HP1 a TIF1 ß v průběhu indukce diferenciace embryonal. pluripotent. buněk (EC P19) V průběhu diferenciace pluripotentních buněk dochází ke kondenzaci chromatinu, což je možno detekovat i v podobě výraznejších/kondenzovanějších chromocenter (DAPI-modře kontrastovaná DNA) a akumulací s chromatinem asociovaných proteinů (jako zde ukázaný TIFip a HP1 proteiny) do těchto oblastí. Současně dochází také ke specifické asociaci mezi jednotlivými typy HP1 proteinů spojených s konkrétními diferencia-čními drahami. PI»/HPla/HPI ÍOVlkOl, CONTROL - nediferencované buňky S-R a SF-R - různé typy diferenciací TSA - inhib. Acetyltransferáz 5dAzaC - inhibitor metyltransferáz 11 i* i? NI • * • J-Z Model změn trankripčního profilu v průběhu indukce diferenciace ES buněk HA - model postupné (hierarchické) aktivace (hierarchical activation) -> metylace DNA ETCM - model povolené/umožněné transkripce (early transcription competence marks) -> modifikace histonů PT - model promiskuitní transkripce (promiscuous transcription) -> kombinace transkripčních faktorů a transdukce signálu Meshorer & Misteli 2006 Modifikace histonů - regulace transkripce ON A A A A. A ON oř □ NA modificalions Historie modřfications * Melfiylated CpG A H3K$ac • H3K9m3 Unmethylaled CpG # H3K4m3 # H3K27m3 A * 1 Í f . Hit*oneH3 |-M> Mm3 KSsC Halone H3 ON B Pnmmg fůí aefcvabon Pfímirsg lor lepresswn PcG ■ r PcG ON PcG Profil postranslačních modifikací (lysinových zbytků) histonů H3 a H4 u ES (J1, V6.5), EC a MEF buněk Dai & Rasmussen 2007 Změny histonových modifikací po působení TSA* u ES a MEF buněk *TSA - Trichostatin: inhibitor deacetyláz Dai & Rasmussen 2007 Polycomb group (PcG) x Trithorax group (trxG) proteins PcG jsou odpovědné za inaktivaci transkripce cílových oblastí trxG jsou odpovědné za aktivaci transkripce cílových oblastí -obecně patří mezi skupinu proteinů modifikujících chromatin - regulují zejména transkripci homeotických genů - význam v ontogenezi - jsou odpovědné za epigenetickou pamět genomu - rozpoznávají specifické a vzájemně málo homologní skvence DNA PRE - PcG responsive element TRE - trxG response element - jedná se o proteinové komplexy se základní jednotnou strukturou (PcG 4 základní skupiny komplexů), specifita těchto komplexů k daným PRE/TRE je dána dalšími asociujícími specifickými podjednotkami (pRC2/3/4|pRC2/3/4|pRC2/3/4 Quiescence Differentiation Checkpoint Stem cell Cell number GO mechanisms renewal expansion ES buňky relativně intenzivně proliferují (podobné nádorovým buňkám) G1 fáze buněčného cyklu je krátká (u mES ~ 1.5 h), zdá se, že chybí Gl-checkpoint* velké procento buněk je v S fázi buněčného cyklu (mES > 60%, hES > 50%) doubling time mES ~ 12h, hES ~ 24h specifická charakteristika regulace buněčného cyklu (odolnost k p16, nízká hladina cyklinů D, vysoká hladina cyklinu E, není potřeba proteinů rodiny Rb) inhibice proliferace (suboptimální podmíky) vede k diferenciaci a apoptóse, diferenciace a apoptósa ES buněk, však nemusí vést ke snížení proliferace jako takové *tzv. kontrolní bod R, o průchodu tímto bodem rozhodují zejména mechanismy rozpoznávající itegritu/neporušenost genomu, buňky s požkozenou DNA jsou za normálních okolností v tomto bodě zastaveny. Porucha tohoto kontrolního mechanismu je typická pro nádorové buňky. Rozdílné proporce v jednotlivých fázích cyklu u časných embryonálních buněk Jak vypadá správná ES buňka? Jsou všechny ES buňky v kultuře stejné? LIF -> STAT3 aktivita u mES buněk A Responsiveness Exogenous LIF Davey, 2006 pokračování v Microarray analýza exprese „stemness" genů ESGVS PEF/LVBlfftoC: 1687 NPC v» LVBr 1737 Fortune!, 2003 pokračování w Model narůstající heterogenity v rostoucí kolonii ES buněk za dodržení známých optimálních kultivačních podmínek Myší ES 30<* 50<* růst kolonie ES buněk Lidské ES Buňky odpovídající buňkám ICM/epiblastu Časného neuroektodermu Buňky primitivního entodermu (morphologicky navíc tvoří také malá granula) *orientační počet buněk v kolonii vývoj blastocysty i-:::> I trofoectoderm Variabilita v analýze transkripčního profilu u ES buněk (ESC), neurálních progenitorů (NPC), progenitorů retiny (RPC) a hematopoetických kmenových buněk (HSC) u myši. Tři pracovní skupiny, jedna metoda. Fortunel Ramalho-Santos Ivanova Fortunel, 2003 mES je možno reverzibilně převést na buňky připomínající buňky primitivního ektodermu tzv. EPL (early-primitive ectoderm-like) buňky. Tyto buňky již nemají podobně jako buňky primitivního ektodrmu schopnost tvořit buňky parietálního entodermu. Také některé jejich další schopnosti diferencovat, jsou oproti ES buňkám pozměněny (Pelton 2002). -LIF + HepG2 buňkami kondiciované médium +LIF (- FGF-5*) Primitive Endoderm + ES Cells EPL Cells BMP A cti vin Wnt Wnt BMP A cti vin M&sod&rmyEndoderm Precursor (Brachy ury+) Ectoderm Mesoderm Endoderm Gadue 2005 *EPL buňky jsou podobně jako buňky primitivního ektodermu exprimují FGF-5 na rozdíl od ES buněk, které exprimují zejména FGF-4 (platí pro myš) VYUŽITÍ ES BUNĚK 1. Biologický a biomedicínský výzkum -Příprava geneticky modifikovaných organismů - Studium mechanismůčasné embryogeneze / diferenciace - Studium mechanismů kancerogeneze - Studium embryotoxicity - Testování farmak 2. Lékařství -Buněčné a tkáňové terapie -Příprava biologicky aktivních preparátů -Nosiče biologicky aktivních látek (pathotaxe) ES buňky v buněčné terapii Příprava geneticky modifikovaných organismů -GMO Pro vytvoření linie GMO je potřeba, aby požadovaná genetická modifikace byly obsažena i v pohlavních buňkách. Tuto modifikaci je tedy potřeba provést na buňkách toti- nebo pluripotentních. • Náhodným nebo cíleným(?) vložením požadované DNA do zygoty • Náhodným nebo cíleným vložením požadované DNA do ES buněk - Díky prakticky neomezené možnosti kultivace ES buněk, lze mít prováděnou genetickou modifikace plně pod kontrolou, a také ji můžeme velice přesně naplánovat!!! - ES buňky jsou pluripotentní, po zpětné injikaci do blastocysty a vložení této blastocysty do dělohy pseudo-pregnantní myši, blastocysta pokračuje ve vývoji a vzniklý jedinec je chimérou buněk původni ICM a injikovaných ES na ůrovni všech tkání, tedy i zárodečné. Příprava KO myší Foster mother I Chiméru mouse Normal mouse Chimera mouse Normal mouse Heterologous Normál mouse Normal mouse for gene knock out 1 Breeding to produce a mouse homo^gous for the gene knockout Diferenciace ES buněk a) In vivo - teratomy: injikace suspenze ES buněk do vaskularizované tkáně imunitně tolerantního zvířete, popřípadě do zvířete s farmakologicky potlačenou imunitní odpovědí - chiméry: injikace ES buněk do blastocysty, navrácení takové blastocysty do pseudo-pregnantní myši = vznik chimerického jedince b) In vitro - metodiky korespondující s ontogenezí - metodiky získané empiricky (kopírující ontogenezi?) Musí buňka diferencující z ES buňky vždy kopírovat ontogenezi aby dosáhla určitého stavu? In vitro diferenciace ES buněk a) Embryoidní tělíska (Embryoid bodies -EB) +jednoduché, více buněčných typů + tolerující genotyp -špatně definované podmínky b) V monovrstvě + dobře definovné podmínky -malávýtěžnost mm \s r m m r g - silně závislé na genotypu ICM - prtuHní f.rjirjhm t.nilin-mriri 1Hi\kn FjíeiľIjiju [jLliiilniLi ľrhiilíLvnL ŕníňilf mi ■ ■ ■■■■■■ hi^i Rathjen 1998 / Bílek 2004 Úloha specifických růstových faktorů v ontogenezi myši ■pibfast Neural crest ___Neurectoderm ^^TfífiÔp**** NeJrůblJit — - NíiUrrjřli. SHUTGFJt Surface ecTnríerm Get m layer morphogenesis Cell movement Mesoderm cnduthekumrhemaÍjopuÍEitit. cells Oermomyotome (dRTmis, muscle) Sclerotome (bDne,rartilflge) Definitive endbderm FGFj SMAD, frcaterifn,Soxl7 Gut Loebel, 2003 Liver Příklady diferenciace myších ES buněk kombinací typu jejich kultivace a specifických růstových faktorů s porovnáním úlohy těchto faktorů v myší ontogenezi □ □ pokračování Zygote j Totipotent I Morula ESCs Blastocyst Pluripotent Ectodenn Mssodsrm Endodsnn <: ? %\ ?c: ? li iiii 3H ^ rfn viva Murtpotent Progenitors Tissues and origsns Embiyoid bodies FGF2 FGF2, FQF2 -p. EGR PDGF BMP4 orascorbate -* RA, db-CAMP -► M-CSF IL3. IL1 -► o-Kit. EPO -► RA Insulin, TS Oligodendrocytes astrocyte* Skin Smooth muscle Macrophage Erythrocytes Adipocytes Ectoderm Mesoderm Endoderm in vitro Cell type GABAergic neurons Glial precursors Dopaminergic neurons Cardiomyocytes Hematopoietic precursors HepatDcytes Undifferentiated ESCs Transplantation into Rodent model Striatum of i^at model for Huntington disease'1 Brain of myelin-deficient rat (Pelizaeus-Merzbacher disease J* Striatum of rat model for Parkinson disease5 Myocardium of dystrophic mice-1 Irradiated mice: myeloid and lymphoid engraflment,rj CCI4 intoxicated liver damage mice*" l-l:.G^i-:liumofinf<-iKtT.:l i*ti GuaSCh, 2005 Příklad účinků jednotlivých specifických růstových faktorů na indukci diferenciace u lidských ES buněk v kombinaci s tvorbou embryoidních tělísek Liver ■ Pancreas NGF jŕ ENDODERM HGF EB ECTODERM Braill Liver jf' Pancreas X' ENDODERM ECTODERM ^ Brain KM Heart Skin Muscle MESODERM Chondrocytes '.Dorsal ^\ ^ Lateral^ . [kail Rlood Intermediate A Kidney Mnllerian duct Muscle Chondrocytes Do ['sal Lateral EGF EB Skin ECTODERM ^ Brain Muscle MESODERM /l>.......A Heart 'Dorsal Lateral Blood Intermediate Kidtiev BMP-4 EB Skin ECTODERM \fESODERM / \ Dorsal Lateral Chondrocytes Ulood FGF EB ECTODERM ■ Skin * Brain MESODERM Muscle /1 \ Dorsal Lateral ■ Intermediate Kidney Heart TGFß EB ECTODERM - r- Brain Musel MESODERM Dorsal Lateral I lean Intermediate \ Mullerian duct Blood RA EB Skin ECTODERM^ Brain Adrenal Muscle MESODERM / \ Dorsal Lateral 11 cart Activin-A HB MESODERM / \ Muscle , r ^ I3eřirt Dorsal Lateral Schuidiner, 2000 Příklad difernciace ES buněk do různých typů neurálních buněk NSC - neural stem cell, DA/Ser/GABA - dopaminergní/serotonergní/gabanergní neurony, MN - motoneurony C 0 0 2 ■ 4 - 6 8 NSC SRM N24bFGF S 10 I « O 16 18 -20 - * 00 Astro SRM - - * * ■ N2 + bFGF + EGF N2 + bFGF EGFKNTF ■ a »■ r * ■ N2 + CNTF Oligo SRM N2 + bFGF + E6F N2 + bFGF EGF+PDGF „i... N2 + PDGF N2 *H-B-B^^-»* DA SRM 1 Ser SRM GABA SRM SRM+fGFB SRM +FGF4 *SHH +SHH N2 + bFGF i. N2 + bFGF N2 + bFGF + SHH + FGF6 +SHH + FGFS ___________ N2+AA N2 + AA + BDNF +BDNF i. H2 + bFGF + SHH* FGF8 N2 + NTÍ * BDNF MN SRM SRM + SHH *RA N2 + bFGF + SHH N2+AA + BDNF I Barberi 2003 Model regenerace poškozené hematopoesy v důsledku Rag2-/- mutace s použitím ES buněk, genetických manipulací a jaderného reprogramování Expand HSC culture and transplant Differentiate intoEBs <3&5jt t Repair of Rag2~ ESCs by homologous recombination \ Rag2~'~ ESCs **» Cultured blastocyst Rag2^~ Culture from tail cells Nuclear transfer into enucleated oocyte Cultured 4-celI embryo Replacement with somatic cell genome Removal of oocyte genome Mature oocyte Rideout, 2002 SOUČASNÉ PROBLÉMY S VYUŽITÍM ES BUNĚK V TERAPII - hES se nedaří dlouhodobě kultivovat beze změn v genotypu / fenotypu - dlouhodobá kultivace za sub-optimálních podmínek vede k dosud neznámým, epigenetickým změnám snižujícím schopnost pluripotence (ireverzibilními i pro cytoplasmu zygoty, Amano 2006) - dosud není spolehlivě vyřešen potencionální vznik teratomů - biologie a diferenciační potenciál ES buněk nejsou dosud dobře prozkoumány - kultivace ES buněk je stále závislá na nedefinovaných faktorech - etika získávání nových lidských ES linií - finance, přes velice atraktivní potenciál, který v sobě ES buňky mají, není jisté, jestli současná společnost bude mít dost prostředků na jejich využití např. v buněčné terapii Chromosomální stabilita a ES buňky Draper, 2004; Hanson, 2005 - dlouhodobá kultivace ES buněk vede k selekci odolnejších klonů a subpopulací - menší responzivnost na vnější signály, rychlejší proliferace, menší nároky na kultivaci, klíčové znaky často zachovány (Oct-4, Nanog, příslušné SSEA,...) - u myší snížena schopnost tvorby chimér a zejména germline u těchto chimér - často spojeno s genetickou manipulací (knock-out, -in ES linie) - nestabilita chromosómů, polyploidie, trizomie, zlomy a přeskupování genů => adaptace na in vitro podmínky - hES, primární je trizomie chromozomu 12 nebo 17, vzácněji chromosomu 14 a 20 - často dochází i ke zdvojení dlouhého raménka chromosomu 17 a k translokaci této kopie na dlouhé raménko chromosomu 6 => posílení exprese genů na chromosomu 17 (Survivin - proti apoptóse, STAT3 - self-renewal mES a nadbytek u většiny nádorů, GRB2 a 7 (growth factor receptor bound protein, viz. signální transdukce)) - na chromosomu 12 je lokalizován nanog (Nanog) - časté i změny malých oblastí na chromosomech 1, 8, 18 a 20 -u mES se jedná o změny zejména chromosomů 8 a 11 (myší chromosom 11 je z části ekvivalentní k lidskému chromosomu 17) Apoptická kontrola nestability karyotypu a ES buňky Checkpoint-apoptosis.... ofkaryotipicinstability. Mantel, 2007 - u zdravých somatických buněk při poruchách mitotického aparátu během jejich dělení a tak vznikající chyby v mitóse vedou k jejich přechodu do senescentního stavu nebo k indukci apoptósy - ES buňky mají zvýšenou toleranci k poruchám mitózy, menší citlivost tzv. SAC (SAC - splindle assembly checkpoint) => akumulace aneuploidních a polyploidních buněk v populaci - indukcí diferenciace lze tyto buňky částečně eliminovat (apoptósa) tetraploidní buňky (blastomery) mohou tvořit jen trofoblast => G1 MTA/tetraploidity checkpoint => využití při tvorbě embryí plně ES původu Příklad nárůstu apoptósy s diferenciací a požkozeným mitotickým aparátem ES - embryonální kmenové buňky EB - ES diferencovanou formou embryoidních tělísek Noc/NOC - nocodazol PAC - paclitaxel Primordiální zárodečné buňky - PGC (primordial germ cell) PGC se u myši objevují již 6 dpc, pravděpodobně je jejich vznik indukovaný v průběhu gastrulace, a to vnějšími signály, zejména BMP (na rozdíl od žab, Drosophily a C. elegans). 6 - 7.5 dpc migrují vně vlastní embryo, později (8.5 dpc <) migrují podél zadního střeva embrya do vytvořené zárodečné lišty. PGC zanikají po usazení v zárodečné liště (10-13 dpc u myši), stávají se z nich zárodečné buňky. Prodělají ještě 2-3 mitózy a u samců vznikají prospermatogonie zastavené v G0/G1 fázi mitózy. U samic vstupují do meiotické profáze (obojí > 12.5 dpc). Podobně jako ICM a ES buňky mají vysokou hladinu alkalické fosfatázy (ale TNAP ne GCAP/TNAP), Oct4, Nanog, .. Významné jsou zdá se zejména Stella a Fragilis. PGC nejsou pluripotentní! PGC mají omezený počet dělení, u myši napočítáno kolem 1000 buněk, rozdíly v závislosti na imbrední lini Stella Také u buněk ES a epiblastu, později jen u PGC, podílí se na udržení jejich fenotypu, po jejich usazení v zárodečné liště jeho exprese vymizí. Fragilis Z rodiny IFN indukovaných genů, je silně exprimován při formování PGC, s jejich migrací jeho exprese klesá. Exprese Oct-4 v PGC I usazených v zárodečné liště Mechanismus vzniku PGC Hayashi, 2007 Hayashi, 2007 EGC jsou odvozeny z primordiálních zárodečných buněk (PGC - primordial germ cell). Podobně jako ES buňky je lze expandovat in vitro, a jsou pluripotentní, jak dokazuje jejich schopnost diferencovat do buněk všech tří zárodečných listů jak in vitro (EB), tak in vivo (chiméry a teratomy). Z epigenetického pohledu (DNA metylace) jsou však více podobné PGC než ES buňkám Rozdíly v metylaci DNA se týkají zejména imprintovaných genů v závislosti na pohlaví, u EGC izolovaných z pozdějších embryonálních stádií se tento rozdíl zmenšuje. Tyto „imprinting-free" PGC, však již netvoří zdravé chimerické jedince. myši lze EGC izolovat z PGC mezi 8.5 - 12.5 dpc, později to již nelze PGC a následně EGC lze izolovat in vitro z ES buněk (lidských i myších) m/hEGC jsou závislé na LIF, během časné kultivace i na FGF2 a Stem cell faktoru (SCF) (+ feeder & FCS/SR). - Exprimují podobné markery jako ES buňky, lidské EGC jsou fenotypem více podobné mES než hES (morfologie + exprese SSEA-1!; u hES se SSEA-1 exprimuje až s jejich diferenciací) Vztahy mezi pluripotentními buňkami a některé klíčové regulační komponenty těchto buněk Sl - Steel locus, Ter - Teratoma locus, pgctl - primordial germ cell tumor susceptibility locus, PTEN -Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10, mTR (mTOR) - serine-threonine kinase mammalian target of rapamycin Donovan, 2003 Schema předpokládaného zapojení FGF, LIF a KL (c-Kit ligand = Steel factor (SF)/ stem cell factor (SCF) v regulaci sel-renewal EG buněk Donovan, 2003 Není původ ES buněk v PGC ??? Zwaka, 2005 Není původ ES buněk v PGC ??? Gene Species ES EGC LGC ICM PE PouSfl (Pesce and Scholer, 2001) M + + + + + Nanog (Chambers etal., 2003) M + + + + + DppaS (Saitou et al., 2002) M + + + + + IfitmS (Saitou et al., 2002) M + + + + + Kit (Hone etal., 1991) M + + + N/D DAZL (Clark et al., 2004) H + + + N/D Ddx4 (Toyooka et al., 2003) M + Akp2 (Chiquoine, 1954) M + + + + + Zfp42 (Rogere et al., 1991) M + N/D N/D + Fgf5(Haub and Goldfarb, 1991; Hebert et al., 1991) M N/D N/D + Gbxl (Chapman et al., 1997) M + N/D N/D + Zwaka, 2005 M- myš; H -člověk; N/D - netestováno; ES - embryonální kmenové buňky; EGC - časné primordiální zárodečné buňky (!); LGC - pozdní primordiální zárodečné buňky; ICM - vnitřní buněčná masa; PE - primitivní ecdoderm/epiblast Kmenové buňky teratomu / teratokarcinomu - ECC Embryonální nádorové buňky (Embryonal carcinoma cells) - Izolované rozkultivováním a klonální selekcí buněk teratomu / teratokarcinomu - Lidské spontálně, myší indukované transplantací časných embryonálních buněk do dobře vyživované tkáně (varlata, ledviná kapsa, břišní dutina,...), musí být imunotolerance - Podobné vlastnosti jako ES buňky, ale méně závislé na specifických růstových faktorech (+) - Tvoří také chiméry, ale nedokonalé, většinou hynou v průběhu embryogeneze (-) - Většinou snížená schopnost pluripotence jak in vivo, tak in vitro (-) - Obecně nestabilní genotyp a časté aneuploidie (-) - Modelové studie genetické nestability a diferenciace, vzniku teratomů - Levnější alternativa k ES buňkám, lepší stabilita v experimentálních systémech jak ES (+) Kmenové buňky extraembryonálních tkání A) Kmenové buňky trofektodermu (trofoblastu) FGF-dependent (FGF4, FGFR2); Cdx2, Eomes, Errfi B) Kmenové buňky primitivního entodermu (hypoblastu) XEN - buňky extraembryonálního entodermu zárodečný epiblast / embryoblast \ primitivní ektoderm ICM allantois amnion blastomery primitivní entoderm mezoderm žloutkového vaku viscerální entoderm parietální entoderm trofektoderm linie trofoblastu Regulace kmenových buněk trofoblastu signály z epiblastu Neurální lišta a kmenové buňky neurální lišty Experiment potvrzujicí pluripotenci buněk neurální lišty