Olga Böhmová 12.2.2010 Speciální imunologické metody – cvičení Téma: Vyšetření slin na přítomnost antigenů krevních skupin Teorie: Antigeny systému ABO (H) se v lidském organismu vyskytují ve dvou formách: První - v alkoholu rozpustné Ag jsou vázány na membrány téměř všech buněk těla, včetně erytrocytů; druhou - tvoří metabolický produkt první skupiny-ve vodě rozpustné Ag přítomné přibližně u 77% lidské populace. Metabolická přeměna je řízena geny Se/se, zcela nezávislými na genech ABO určujících příslušnost ke krevní skupině. Dominantně recesivní kombinace sese zajistí dokonalý rozklad vázaných Ag a tedy nepřítomnosti Ag v tělních tekutinách. Tito jedinci se označují jako nevylučovatelé (nonsekretoři). Jedinci s dominantní alelou Se v genotypu mají Ag přítomny v tělních tekutinách a označují se vylučovatelé (sekretoři). Cíl: Zhodnocení výskytu vylučovatelů a nevylučovatelů ve skupině studentů Metoda: Adsorpčně inhibiční metoda (AI) jejímž principem je inhibice hemaglutinace, je založena na vysycení vazeb míst na Ag přítomných ve slinách přidaným aglutinačním sérem vhodného titru a následným stanovením množství nenavázaných Ab přidáním určitého množství (20µl) 5% suspenze odpovídajících erytrocytů. Intenzita aglutinace je nepřímo úměrná množství skupinových substancí ve slinách. Absorpčně inhibiční metoda je složena ze dvou fází: 1. absorpce. K vyšetřovanému vzorku (antigenu) se dodá známé množství protilátky, do jde k vazbě antigen-protilátka. 2. aglutinace. V této fázi je zjišťována kvantita nenavázaných protilátek poklesem jejich titru. Pokles se projeví inhibicí aglutinace přidaným náplavem známých krvinek o známém objemu a koncentraci. Použití: Hemaglutinačně inhibičního testu se hojně užívá k průkazu slabých A a B aglutinogenů a při zjišťování ABO substancí v buňkách lidských tkání, ve spermiích, na leukocytech, trombocytech a v krevních skvrnách. Materiál: komerční séra (EXBIO Olomouc) anti-A (IgM) monoklonální1, anti-B (IgM) monoklonální1, lektin anti-H; náplav diagnostických erytrocytů A,B,O; destičky s otvory, fyziol. roztok 0,85% (0,15 mmol/l) NaCl, vodní lázeň na 100%C Postup: Příprava sér: Jako vhodná ředění sér byla experimentálně vybrána 1:8 pro anti-A, 1:32 pro antiB a 1:2 pro lektin anti-H. Příprava 5% suspenze (náplavu) diagnostických erytrocytů (čisté krvinky bez bílkovin plazmy a séra): připravená kapilární krev skupin A, B, O. 100 ml krve se v označených zkumavkách dvakrát promyje fyziologickým roztokem a zcentrifuguje do 1500 ot/min. Po odstranění supernatantu se přidá 900 ml fyziologického roztoku. Zpracování slin: Sliny vyšetřovaných osob se zahřívají v čisté skleněné nádobce v množství asi 2 ml při teplotě 100 °C ve vodní lázni po dobu 10 minut k inaktivaci enzymů, aby nedošlo k natrávení, a tím snížení množství skupinových substancí. Varem ztratí sliny svou vazkost, stanou se tekutějšími a lépe se zpracovávají. Sliny se pak centrifugují při 2000ot./min po dobu 10 minut, tím se odstraní koagulovaný hlen a buněčný detrit. Čirá tekutina se ze supernatantu pipetuje do sterilní zkumavky. Samotný pracovní postup: Sliny naředíme fyziologickým roztokem na základní ředění 1:100 a 1:200. U kontrolních zkumavek se sliny nahrazují fyziologickým roztokem, proto pipetujeme po 30 ml fyziologického roztoku do všech 12 zkumavek. Do 4 zkumavek řady A přidáme po 20 ml séra anti-A 1:8, do zkumavek řady Bpo 20 ml séra anti-B 1:32, do zkumavek řady H po 20 ml séra anti-H 1:2. Směs promícháme a ponecháme při laboratorní teplotě po dobu 20 minut. Poté přidáme 20 ml 5% suspenze erytrocytů, vždy příslušných danému séru, tzn. do zkumavek řady A erytrocyty skupiny A, do zkumavek řady B erytrocyty B, do zkumavek řady H erytrocyty O. Zkumavky jemně promícháme a necháme 10 minut odstát při laboratorní teplotě. V jednotlivých řadách skupin A, B a H je tedy množství sér i erytrocytů konstantní, liší se pouze množství slin, a to sestupně. Dalším krokem je centrifugace všech zkumavek při 1000 ot./min po dobu jedné minuty. Anti-A a anti-B jsou absorbovány snadno, centrifugace je dostatečná. Protilátky anti-H nereagují tak dobře, proto je třeba zkumavky řady H protřepat a znovu centrifugovat 1 minutu při 1000 ot./min. Po centrifugaci jsou zkumavky připraveny k hodnocení (odečítání). Výhodou aglutinačně inhibičního testu je, že negativní výsledek je dán přítomností aglutinace, a tudíž máme kontrolu, že jsme umístili do zkumavek sérum a erytrocyty stejné specifičnosti. Odečítání a hodnocení výsledků: Je-li ve vyšetřovaných slinách vyšetřovaný antigen a přidané erytrocyty se neshlukují, značí to, že antigen slin vysytil diagnostický titr aglutininu a můžeme s určitostí říci, že jde o sliny vylučovatele. Jde-li o sliny nevylučovatele, přidané krvinky jsou diagnostickým sérem aglutinovány. Při vizuálním hodnocení se zaznamená pro každou zkumavku stupeň aglutinace podle následujících pravidel ++++ kompletně shluklý kompaktní sediment +++ sedimentované erytrocyty se po jemném poklepání na dno zkumavky rozdělí na 2-4 nepravidelné hrudky ++ sediment se rozpadne na víc drobných částí + sediment zůstane po poklepání na dno zkumavky ve tvaru jemně zrnitého písku - negativní reakce, sedimentované erytrocyty se volně zvíří ve fyziologickém roztoku Výsledky: 1:200 1:100 Ab anti-H Ab anti-B Ab anti-A 1. vzorek Olga Böhmová Závěr: U mého vzorku byla prokázána přítomnost antigenu ve slinách, jelikož došlo k inhibici hemaglutinace. Naskytl se však problém, že u vzorku kolegyně Moniky došlo k inhibici hemaglutince po nanesení jak anti A, tak i anti-H protilátky, což lze vysvětlit prošlým datem expirace.