Fagocyty Fagocytóza, faktory fagocytů Komplementový systém Reakce cévního endotelu \ / Prostanoidy * Mechanismy obranného zánětu * Kmmy Srážení krve Specifická fáze zánětu nedegradované Ag štěpy jsou ve vazbě s MHC proteiny prezentovány lymfocytům Ilja Mečnikov Fagocyty larev mořské hvězdice obklopily třísku; phagocytóza & digesce bakterií MOs & PM NS — poprvé použit pojem fagocyt: Původ z řeckých slov phagein - jíst cytos - buňka Buněčná podstata imunity Nobelova cena 1908 Elie Metchnikoff (Courtesv National Library of Medicíne) Neutrofily > phagocytóza, intracelulární zabíjení, zánět, poškození tkání > charakteristické jádro > granula a CD66 membránový marker > krátce žijící, v nadbytku v krvi, chybí ve zdravé tkáni Polymorfonukleární leukocyty (PMNs) *40-65% všech leukocytu (3-5 x 103 /ul krve) *první obranná linie v boji proti patogenním mikroorganismům *chemotaxe *fagocytóza *generování RMK a RMD *degranulace Monocyty/Makrofágy > fagocytóza, zabíjení, obnova tkání, prezentace antigenu pro specifickou im. odpověď > charakteristické jádro a CD14 membránový marker. adherují na plast a sklo > aktivují se působením cytokinů, > samy cytokiny produkují > likvidují i maligní a pozměněné vlastní struktury NK cell TH2 cell Tissue macrophage Regulatory T eel Immune complexes Prostaglandins GPCR ligands Glucocorticoids Apoptotic cells IL-10 Classically activated macrophage microbicidal activity] Wound-healirig macrophage (tissue repair} Regulatory macrophage (anti-inflammatory activity} Ftcmt J. C ytfrtnae: produced by immune c*IL can gir* r/ist to macrophage wilh distinct physiologic 3- Classically aca-vateü macrophage: jji:* in response- to mterfer&n-y (IFN?), t.-.cz can be produced duruig an adaptive linimixp ne^pxjnse by T helper 1 (ThO ör CD8TT cells fried: shown)ordurinE an innatekmEnine respond by naturalkiller {NK)cells.andram our-nE era is actor (TlfF). TChich es produced fry an£iEe^-pi-e:ennng cells (APCs). Wound -he- ding (alternatively activated} macrophaeö: arise in response to Lnterleukin-l (IL-4}. ■which can be produced during an adaptive immune response by T-fil cell: or duiinE at innate ianmrr.e response by giaiiuJocytes. KjG-Euhtory macrophages are genera.ted in respoas-e to various stimuli. sndudinF immun* complexES. prostaglandins, Cr-proteiu coupled receptor (GPC R.) □ avid M. Mosser and Justin P. Edwards Vht Xev ImTBWKi. Aattoi ammicr-pr aviliit.E ul PMC 1KB Aipm II. Monocyty/makrofágy Neutrofily Morfologie Velké mononukleární buňky Malé buňky s „multi-lobed" jádrem Lokalizace Krev/tkáně Krev - odvod do místa infekce Po zabití bakterie Migrují do lokálních lymf. uzlin Umírají na místě apoptózou (zbytek je zlikvidován makrofágy) Prezentace antigénu Mohou prezentovat Ag (MHC 2. třídy) Nemohou prezentovat Ag (neexprimují MHC 2. třídy) Aktivace fagocytů v zánětu SOSsignály -N-fMLP -PGs,LTs,PAF -Komplement -Prozánětlivé cytokiny Odpověď fagocytů - chemotaxe - adherence - diapedéza - aktivace - Peptidy z kaskády srážení krve -fagocytózaazabití 1 Jak neutrofily dosáhnou místa infekce ? 1. Rolling 2. Activation 3, Arrest/ adhesion 4. Migration r Integriu selectin Inflaniniatory cytokines • A A Activation (chemo attr acta n ts) Che moattiactan ts DIAPEDESIS INFLAMMATION SITE PHAGOCYTOSIS DEGRANULATION OXIDATIVE ACTIVITY TISSUE DAMAGE Tissue Adh(%ioii receptor on neutrophils receptor endot beliaJ ±11*._ Implicat in Solo c tin. irrt eract »iit> plaOsL^fCDlj) sclect in(CD62L) P-selectiiL(CD62P ) E-selectin(CP62E) Leukocj'iG rolling GlyCAM-1 others neutrophil hi n 31), HCAM( CD 4-4) PEC A M- 1 ( CD31 > Pot entiat inj ; adhesion, transendo 11 lial [ tii,'*r;i tion Receptor binding hyalurona tc and other molecules of connect ive t i ssue Gh/O AM: Glyoosaminoglycan—ceU adhesion molecule; HCAM: homing cell adhesion molecule; 1CAM 1, ICAM-2; intercellular adhesion molecule 1,2; LFA-1: leukocyte function associated antigen 1; PECAM: platelet endothelial adhesion molecule; sLex: sialylated Lewis antigen X; VCAM-1: vascular cell adhesion molecule; ArLA-4: very late antigen 4 Opsonizace Ingesce fagocytem (Fc receptory, CR) niciace fagocytózy Adheze cestou U ScavengerR U IgG FcR W CR Toll-like R Zabíječské mechanismy fagocytů Class of mechanism | Specific products Acidification pH=~3.5-4.0, bacteriostatic or bactericidal Toxic oxygen-derived products Superoxide 02~ hydrogen peroxide H202, singlet oxygen 102, hydroxylradical OH" hypohaliteOCI" Toxic nitrogen oxides Nitric oxide NO Antimicrobial peptides Defensins and cationic proteins Enzymes Lysozyme-dissolvescell walls of some Gram-positive bacteria. Acid hydrolases—further digest bacteria Competitors Lactoferrin (binds Fe) and vitamin Bi2-binding protein Figure 2-6 Immunobiology, 6/e. (© Garland Science 2005) Charakteristika granulí neutrofil ů primární granula azurofilní; charakteristické pro mladé neutrofily Obsahují: neutrální proteasy - cathepsin G, elastasa, proteinasa S lysozym, defensiny, proteásy, fosfolipasu A2 a myeloperoxidasu sekundární granula specifické pro zralé neutrofily obsahují lysozym, NADPH oxidasa, laktoferrin, elastasa, kolagenasa Terciární granula - na předním konci migrujících fagocytů -gelatinasa (destrukce membrán) Lysozomy -obsahují kyselé hydrolasy Sekreční váčky - reservoir membránových komponent Microbe or other particie Plasma membrane i© O^^t—phagosome I ) (phagocytic Cytoplasm-/— vesicle) Lysosome V Digestive enzymes Pnagocyte Partially digested microbe Phagolysosomes Residual body Indigestible material Q Chemotaxis and adherence of microbe to phagocyte. Q Ingestion ol microbe by phagocyte. ^ Formation of a phagosome. Q Fusion of the phagosome with a lysosome to form a phagolysosome. {J Digestion of ingested microbe by enzymes. Q Formation of residual body containing indigestible material. Q Discharge of waste materials. (a) Phases of phagocytosis Copyright © 2001 Benjamin Cummings, an imprint ol Addison Wesley Longman, Inc NADPH OXIDASE ACTIVATION CYTOSOL Schematic representation of the NADPH oxidase enzyme. The integral membrane of the phagocyte consists of two subunits: p22phox and gp91phox which respectively produce the smaller and larger cha in of the cytochrome-b558. Two cytosolic subunits: p67 phox and p47phox; a p40phox acces sory protein and a Rac- GTP binding protein then translocate to the cell membrane upon cell activation to form the NADPH oxidase complex which generates a respiratory burst. Superoxide can react to form hydrogen pe roxide and hypoc hlorus ac id, whi ch together participate in bacterial killing. Assari Medical Immunology 2006 5:4 doi:10.1186/1476-9433-5-4 SIMULÁCIA GLUKÓZA GSH - PEROXIDAZA GSSG REDUKTAZA CNADP + NADPH ■ NADPH NADPH - OXIDÁZA CO, SVETLO KATALAZA PEROXIDACIA CIO" HALOGENIZÁCIA PEROXIDACIA LIPIDOV DEŠTRUKCIA MEMBRÁN FRAGMENTÁCIA PROTEÍNOV POŠKODENIE DNA 0 = C Obr. 155. Schéma respiračného vzplanutia fagocytov a tvorby toxických foriem kyslíka HMPS — hexózomonofosfátový skrat. G6PD glukó/a-6-fosfátdehydrogenáza. GSSG a GSH — redukovaná a oxidovaná forma glutationu, NADPH a NADP* -- redukovaná a oxidovaná forma nikotinamidadenindinukleotid-fosfálu, SOD — superoxiddismutáza. M PO myelopcroxidáza. Or, superoxidový aniónový radikál. OH — hydroxylový radikál. 70, singletový kyslík Oxidative activity Dismutation XOH + H+ H2O2 -2 e X- + H2O Nat. enz. CI", Br-, I-, "SON Comp. I / AH Myeloperoxidase Comp. II Reaktivní formy kyslíku a dusíku Volné radikály Látky neradikálové povahy Reaktivní formy kyslíku Superoxid Peroxid vodíku H2O2 Hydroxylový radikál HO- Kyselina chlorná HOCl Alkoxylový radikál RO* Ozon O3 Peroxylový radikál ROO* Singletový kyslík ^2 Reaktivní formy dusíku Oxid dusnatý NO- Peroxynitrit ONOO- Oxid dusičitý NO2- Dusitany NO2- Dusičnany NO3- Nitrosyl Správná funkce fagocytů je pro organismus nezbytná Deficience ve funkcích fagocytů = těžký průběh banálních infekcí. Příklad: CGD - defektní NADPH oxidáza Naopak hyperaktivace fagocytů - problémy: poškození okolních buněk a tkání reaktivními metabolity a proteolytickými enzymy Metody stanovení reaktivních metabolitů kyslíku fag ocyty Kolorimetrické metody Stanovení spotřeby kyslíku Elektronová paramagnetická rezonance Luminometrické metody Fluorescenční metody Kolorimetrické metod NBT test - princip metody spočívá v redukci žluté tetrazoliové soli (NBT) superoxidem na modrý produkt formazan. Redukce cytochromu c - superoxidový anion redukuje bezbarvý oxidovaný (ferri-) cytoc hrom c na bar evnou formu. Stanovení spotřeby kyslíku Metoda založená na detekci změny koncentrace kyslíku v médiu pomocí Clarkovy elektrody. Je používána především k detekci intenzity respiračního vzplanutí. Elektronová paramagnetická rezonance Radikál reaguje s příslušnou próbou (tzv. spin-trapping). Následně jsou pomo cí speciálního přístroje analyzována paramagnetická spektra. Luminometrické metody Luminometrické próby (luminofory) jsou oxidovány RMK Při návratu do základní ho energetického stavu emitují fotony. Jejich detekce je možná pomocí luminometrů nebo scintilačn ích spektrofotometrů. Nejčastěji používané luminofory: - Luminol - Lucigenin - Izoluminol - Pholasin PHOLASIN Photoprotein of the bioluminescent mollusc Emits light in the p resence of free radicals, oxidants and oxidases Pholasin is isolated and purified by: Knight Scientific Limited (UK) 100 SO 60 4O 20 O O Luminol + S. mutans 10 2OSO 4O time (min) 50 60 o 250 200 |150 (100 50 0 0 Luminol + opsonized S. mutans 10 20 SO 40 time (min) 50 60 Fluorescenční metod Princip Reakcí s RMK se původně nefluorescenční látky (tzv. fluorescenční próby) mění na látky fluorescenční. Tuto fluorescenci je možné detekovat pomocí: - fluorimetru - fluorescenčního mikroskopu - konfokálního mikroskop u - flow cytometru Výhody detekce pomocí flow cytometru - analýza velkéh o počtu buněkvkrátkém čase (1000 buněk/sec) - možnost současného hodnocení více buněčných populací v jednom vzorku Příkladem fluorescenčních prób jsou: dichlorofluorescin diacetate, dihydrorhodamin 123 nebo hydroethidin DCFH-DA DCFH DCF 2',7'-dichlorofluorescin diacetate O o CH3-C-^V,^^||^ O-C-CH3 COOH 2',7'-dichlorofluorescin HYrOxyH Cellular Esterases C^n/^^^s/^ Cl Hydrolysis t^f Fluorescent COOH H2O2 DCFH-DA 1 Oxidation 2',7'-dichlorofluorescein HO O O Cl Cl COOH Monocytes Lymphocytes 11» li j» vi sä tl log FITC Fluorescence 1000 Detekce NO - cell-permeabilní fluorescenční indikátory (4,5- diaminofluorescein diacetate (DAF-2 DA) - celková koncentrace nitrátů/nitritů - aplikace NO donorů compounds, NO scavengerů, a guanylyl cyklásy - NOS aktivita v buněčných homogenátech měřením enzymatické konverze argininu na citrulin během tvorby NO -inhibitory NOS (L-NAME) - aplikace protilátek k isoformám NOS (imunocytochemie, imunoblotting) - exprese genu pro iNOS