C7188 Úvod do molekulární medicíny 7/12 MOLEKULÁRNÍ FARMAKOLOGIE I Ondřej Slabý, Ph.D. Masarykův onkologický ústav Univerzitní centrum buněčné imunoterapie Lékařská fakulta Masarykovy univerzity © Ondřej Slabý, 2009 logo_MOU ucic_logo_text_en GS011558 Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 2 © Ondřej Slabý, 2009 Příklady z historie a základní pojmy farmakologie 1897 Felix Hoffmann, chemik, který pracoval pro německou firmu Bayer, vyrobil derivát kyseliny salicylové esterifikací jedné hydroxyskupiny. Rozvoj farmakologie 1964 dvojí účinek adrenalinu beta-blokátory – propranolol – James W. Black 1975 antagonista H2-receptoru – cimetidin James W. Black THALIDOMIDOVÁ TRAGÉDIE 1951-56 (10tis dětí) Náhoda ve vývoji léčiv penicilin, chlorpromazin, viagra NCE, me too drugs, generika Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 3 © Ondřej Slabý, 2009 •Definice: –„farmakologie je věda zabývající se interakcí chemické látky (léčiva) s živým organismem“ FARMAKOKINETIKA → řecky farmakon = lék, řecky kinein = pohybovat zkoumá osud léku v organismu (působení organismu na lék), tj. vstřebávání (absorce), rozdělování v jednotlivých tkáních (distribuce), přeměnu na účinné a/nebo neúčinné látky (biotransformace) a vylučování (eliminace). FARMAKODYNAMIKA → řecky farmakon = lék, řecky dynamis = síla, zabývá se účinkem a mechanizmem účinku léčiv i nežádoucích organismus léčivo farmakodynamika farmakokinetika Příklady z historie a základní pojmy farmakologie Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 4 © Ondřej Slabý, 2009 © Ondřej Slabý, 2009 Dávka podaného léčiva FARMAKOKINETIKA FARMAKODYNAMIKA DISTRIBUCE BIOLOGICKÁ DOSTUPNOST Léčivo distribuované v tkáních Léčivo metabolizované nebo vyloučené Koncentrace léčiva v systémové regulaci Koncentrace v místě účinku CLEARANCE Toxicita DISTRIBUCE Klinická odpověď Farmakologický účinek Účinnost Mechanismus působení (action) léčiv Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 5 © Ondřej Slabý, 2009 Farmakokinetika C:\WINDOWS\Plocha\05.jpg Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 6 © Ondřej Slabý, 2009 6 Strana 3 © Ondřej Slabý, 2009 C:\Dokumenty\bakalari\kapitoly-bak\obecna\obrazky\1.gif Absorpce - průnik rozpuštěného léčiva z místa podání do krve – nutná pro celkový účinek - systémový enterální (do trávicího ústrojí): per os (ústy) per rectum (do konečníku) parenterální (s obejitím střeva): intravenózní - i.v. intraarteriální - i.a. intramuskulární - i.m. subkutánní - s.c. sublinguální na kůži na nosní sliznici inhalační Farmakokinetika Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 8 © Ondřej Slabý, 2009 Farmakokinetika Účinek nastupuje do 30 minut. modifikující faktory: · pH žaludku, enterosolventní obal · současně požitá strava · motilita GIT · stav GIT—žaludeční kyselina, žlučové kyseliny, pankreatické a střevní šťávy · stav jater - městnání ve v. portae efekt prvního průchodu – esintegrace, desagregace, disoluce Enterální podání účinek nastupuje do 15 minut jak pro místní účinek, tak pro systémový léková forma nesmí dráždit sliznici rekta, Per rectum (čípky) Intravenózní (i.v.) - injekce, infúze účinek nastupuje do 1-2 minut - znamená, že se téměř ihned všechno podané léčivo dostává do žilního a vzápětí rychle i do tepenného krevního oběhu - odpadá fáze absorpce Úvod do molekulární medicíny 7/12 © Ondřej Slabý, 2009 Strana 9 průnik léčiva s krve do tkání dynamický děj, kde nás zajímá: rychlost - která závisí na: vazbě, průniku před biomembránu průtoku orgánem stav - distribuční rovnováha, kdy se vyrovnají podíly volných frakcí léčiva v plazmě a ve tkáních Distribuční objem-Vd – hypotetický poměr mezi množstvím léčiva v organizmu a dosaženou plazmatickou koncentrací Distribuce Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 10 © Ondřej Slabý, 2009 Biotransformace - metabolizmus Procesy probíhající převážně v játrech, ale i v ledvinách a jiných tkáních těla. Enzymatické procesy biodegradace bioaktivace (prodrug) enalapril-enalaprilát kodein-morfin 1. Fáze: oxidace, hydrolýza -je zachována určitá liposolubilita 2. Fáze: konjugace - látky se stávají rozpustné ve vodě. ELIMINACE LÉČIV Z ORGANISMU Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 11 © Ondřej Slabý, 2009 Reakce I. fáze (tab. 6A) představují oxidaci za přítomnosti CYP450, redukci a hydrolýzu aj., nebo jsou na CYP450 nezávislé. Molekula látky se zmenšuje. Reakce II. fáze (tab. 6B) jsou děje vedoucí ke konjugaci molekuly léčiva s kyselinou glukuronovou, sírovou, acetátem, glutationem aj. S výjimkou acetátů vznikají polární metabolity, tj. rozpustné ve vodě, které se snadno vylučují zejména glomerulární filtrací. Některé z nich (např. glukuronidy) se navíc sekretují do moče aktivním transportem ledvinnými tubuly. Molekula látky se zvětšuje. A. reakce I. fáze Typické substráty Oxidace dependentní na CYP450 Hydroxylace Barbituráty, amfetaminy, fenytoin N-dealkylace Morfin, kofein, teofylin O-dealkylace kodein N-oxidace Acetaminofen, nikotin S-oxidace Tioridazin, cimetidin, chlorpromazin Deaminace diazepam Oxidace nedependentní na CYP450 Oxidace aminů adrenalin Dehydrogenace etanol Redukce Chloramfenikol, naloxon, dantrolen Hydrolýza: hydrolýza esterů Prokain, acylpyrin, klofibrát hydrolýza amidů Prokainamid, lidokain, indometacin B. reakce II. fáze Typické substráty Glukuronidace Acetaminofen, morfin, diazepam, digitoxin Acetylace Sulfonamidy, izoniazid, klonazepam Konjugace s glutationem kyselina etakrynová Konjugace s glycinem kyselina salicylová Konjugace s kyselinou sírovou metyldopa, acetaminofen Metylace adrenalin, noradrenalin, dopamin Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 12 FARMAKODYNAMIKA MECHANISMY PŮSOBENÍ LÉČIV I.Nespecifické, fyzikálně chemické působení léčiv II.Specifické působení léčiv §cílové struktury specifického působení 1.receptory 2.iontové kanály 3.enzymy 4.transportní (přenašečové; kariérové) systémy 5.jiné struktury Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 13 © Ondřej Slabý, 2009 I.Nespecifické, fyzikálně-chemické působení léčiv I.1. Látky působící osmotickými vlastnostmi -působí tak látky samy neprostupující přes buněčné membrány, které jsou však prostupné pro vodu (mannitol) I.2. Látky ovlivňující acidobazickou rovnováhu -příkladem mohou být antacida, látky měnící pH moče (např. acidifikující sůl – chlorid amonný - při otravě amfetaminy) I.3. Látky působící oxido - redukčními vl. -některá desinficiencia (např. peroxid vodíku) působí jako oxidující látka, methylenová modř se pro své redukující schopnosti používá k léčbě methemoglobinémie, expektorancia typu N-acetylcysteinu působí redukci disulfidických můstků glykoproteinů hlenu I.4. Adsorbencia typickým příkladem látky s velkým povrchem vázajícím (adsorbujícím) jiné látky, toxiny, apod. je adsorpční (živočišné; aktivní) uhlí I.5. Surfaktanty, detergentia ovlivňují povrchové napětí membrán buněk, používají se jako desinficiencia a antiseptika (mýdla, benzyldodecinium bromid, carbethopendecinium bromid aj.) - Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 14 © Ondřej Slabý, 2009 Celková anestetika -podle tzv. lipidní teorie Overtona a Meyera (1899-1901) je působení celkových anestetik založeno na jejich liposolubilitě Chelátotvorné látky - vytvářejí s těžkými kovy různě stabilní komplexy – cheláty, čímž brání vazbě kovu s endogenními ligandy; cheláty by měly být netoxické, mít vysokou rozpustnost ve vodě → předpoklad pro rychlou renální exkreci (př. může být dexrazoxan – cyklický analog EDTA podávaný současně s anthracykliny k potlačení kardiotoxicity → vazba Fe2+ iontů) I.Nespecifické, fyzikálně-chemické působení léčiv Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 15 © Ondřej Slabý, 2009 II. Specifické působení léčiv •působení naprosté většiny léčiv není založeno pouze na jejich fyzikálně-chemických vlastnostech → je podmíněno schopností vázat se specificky na určitou makromolekulární strukturu tkání; tyto struktury „rozpoznávají“ pouze molekuly léčiv s přísně určeným chemickým uspořádáním, včetně prostorové konfigurace → stereospecifické působení Strana 16 © Ondřej Slabý, 2009 Úvod do molekulární medicíny 7/12 Cílové struktury specifického působení léčiv 1.receptory 2.iontové kanály 3.enzymy 4.transportní (přenašečové; kariérové) systémy 5.jiné struktury nikotinový rec Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 17 © Ondřej Slabý, 2009 1. Receptory •„buněčné makromolekuly, které jsou spojeny přímo a specificky s přenosem chemického signálu uvnitř a mezi buňkami; spojení hormonu, neurotransmiteru, léčiva či druhého posla („messenger“) s příslušným receptorem vede ke změně buněčné funkce“ •tab. zobrazuje základní třídy receptorů Kód Třída 1.0. receptory spojené s iontovými kanály 2.0. receptory spjaté s G-proteiny 3.0. receptory s enzymovou aktivitou 4.0. receptory regulující transkripci Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 18 © Ondřej Slabý, 2009 Receptory spřažené s iontovými kanály (ionotropní receptory) •typické pro rychle působící neurotransmitery: (excitační – nikotinové, glutamátové rec., inhibiční GABAA rec.) •rychlá odpověď (řádově ms) •jiné příklady: 5-HT3 rec. → antagonisté → antiemetika (ondansetron, granisetron) → blok 5-HT3; receptory pro glycin podobné GABAA rec. Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 19 © Ondřej Slabý, 2009 Receptory spjaté s G-proteiny (metabotropní) •název odvozen od skutečnosti, že váží GDP nebo GTP •funkce G-proteinů •tři základní typy G-proteinů: §Gs: systém adenylátcykláza/cAMP §Gq: systém fosfolipáza C /inositolfosfatidy §Gi: systém iontových kanálů Gs Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 20 © Ondřej Slabý, 2009 Gq Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 21 © Ondřej Slabý, 2009 příklady Gs •β-adrenergní •podskupina D1 dopaminových receptorů - zahrnuje D1 a D5 •histaminové H2 receptory (žaludeční sliznice, srdce, hladký cévní sval) •odpověď se dostavuje řádově v sec (platí pro G-proteinové receptory obecně) Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 22 © Ondřej Slabý, 2009 příklady Gq •α1-adrenergní receptory •některé metabotropní receptory excitační aminokyseliny glutamátu → spojeny s tvorbou IP3 → a excesivním uvolněním vápníku, což může přispívat k excitotoxicitě Glu (= navození neuronální smrti) •histaminové H1 receptory (hladké svaly bronchů, střeva, endotelové buňky)→ vasodilatace, ↓ TK, ↑permeability cév, edém Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 23 © Ondřej Slabý, 2009 příklady Gi •muskarinové receptory Ach v srdci (M2) •opioidní receptory (μ-rec.) •podskupina D2 receptorů – zahrnuje D2, D3 a D4 rec.; tato podskupina zprostředkovává známé účinky DA (agonisté – dopamin, apomorfin, bromocriptin; antagonisté – neuroleptika) •GABAB rec. (agonista – baclofen) •cannabinoidní receptory CB1 a CB2 (v CNS i na periferii – lymfatická tkáň; agonista - nabilon) • Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 24 © Ondřej Slabý, 2009 Receptory spojené s enzymovou aktivitou •receptory pro růstové faktory, interleukiny, insulin aj., jsou spojeny s tyrosinkinasovou aktivitou •receptor pro atriální natriuretický peptid (ANP) je spřažen s guanylátcyklásovou aktivitou •odpověď řádově v min Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 25 Receptory regulující transkripci (jaderné receptory) •tato třída má dvě podtřídy: §podtřída nesterodiních receptorů (např. rec. pro hormony štítné žlázy, vitamin D, kyselina retinova) §podtřída receptorů steroidních (např. rec. pro hydrokortison, testosteron, aldosteron, aj.) §receptory regulující transkripci → lokalizovány v buněčném jádře, případně v cytosolu §účinky se plně rozvíjí během hodin až několika dnů (nutná syntéza proteinů), viz obr. Úvod do molekulární medicíny 7/12 © Ondřej Slabý, 2009 Strana 26 Úvod do molekulární medicíny 7/12 © Ondřej Slabý, 2009 Strana 27 © Ondřej Slabý, 2009 2. Iontové kanály •např. lokální anestetika blokují sodíkové kanály membrán neuronů (i kardiomyocytů) a tím blokují šíření AP (benzokain – vně, lidokain, tetrakain ad. – blok zevnitř) •blokátory vápníkových kanálů snižují vstup vápenatých iontů do hladkého svalu (především cévního) a do kardiomyocytů → vasodilatace) •blokátory draslíkových kanálů (deriváty sulfonylmočoviny, meglitinidy, flupirtin – s elective neuronal potassium channel opener) Strana 28 © Ondřej Slabý, 2009 Úvod do molekulární medicíny 7/12 3. Enzymy •obvykle kompetitivní inhibitory enzymů: §reversibilní: wacetylcholinesteráza – fyzostigmin wfosfodiesteráza – methylxantiny wGlu-dekarboxyláza – valproát winhibitory 5α reduktázy - finasterid §irreversibilní: wacetylcholinesteráza – organofosfáty wcyklooxygenáza – ASA, nesteroidni antiflogistika a kortikoidy wMAO-B – selegilin waldehyddehydrogenasa – disulfiram •některé látky působí jako tzv. falešné substráty: §dopa-dekarboxyláza – methyldopa (místo NA vzniká methylnoradrenalin = korbadrin) Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 29 © Ondřej Slabý, 2009 4. Transportní (přenašečové) systémy („carriers“) •membrány různých buněk jsou vybaveny specializovanými proteinovými molekulami schopnými transportovat přes lipoidní membránu ionty či hydrofilní molekuly •tab.: transportní systémy jako cílová místa působení léčiv Bez názvu Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 30 © Ondřej Slabý, 2009 5. Další struktury •tubulin je místem působení kolchicinu •DNA je přímo poškozována alkylujícími cytostatiky, radiomimetiky; podobně působí i některá antibiotika (nitrofurantoin) •používáme nejrůznější enzymy (asparagináza → blokáda proliferace nádorových buněk, deoxyribonukleasa → štěpí mimobuněčnou DNA u pacientů s cystickou fibrózou) • Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 31 © Ondřej Slabý, 2009 Vývoj nových léčiv Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 32 © Ondřej Slabý, 2009 Vývoj nových léčiv Research based pharmaceutical companies, on average, spend about 20% of their sales on research and development (R&D). This percentage is significantly higher than in most other industries, including electronics, aerospace, automobiles, and computers. Since 1980 US pharmaceutical companies have practically doubled spending on R&D every 5 yrs Despite these enormous expenditures, there has been a steady decline in the number of drugs introduced each year into human therapy. 70-100 in the 60s 60-70 in the 70s ~50 in the 80s ~40 in the 90s Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 33 © Ondřej Slabý, 2009 “Innovation Deficit” - coined in 1996 by Jurgen Drews, president of research at Hoffmann-LaRoche. Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 34 © Ondřej Slabý, 2009 Reasons for the innovation deficit: a) increased demand on safety for drugs. - the average number of clinical trials per new drug application (NDA) increased from 30 in the 70s to 40 in the 80s, to 70 in the 90s. - the increased demand on safety is also reflected in a prolonged duration of the drug development process. In the 60s, total development time was 8.1 yrs In the 70s, total development time was 11.8 yrs In the 80s, total development time was 14.2 yrs In the 90s, total development time was 14.9 yrs Currently, total development time is ~16 yrs b) “low hanging fruit” have been picked. 90% of all drug development candidates fail to make it to market. Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 35 © Ondřej Slabý, 2009 A new drug today costs ~$880 million and takes ~15-16 yrs to develop. Allocation of R&D funds Allocation of R&D time Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 36 © Ondřej Slabý, 2009 Drug discovery process – vývoj nového léčiva The identification of new, clinically relevant, molecular targets is of utmost importance to the discovery of innovative drugs. It has been estimated that up to 10 genes contribute to multifactoral diseases. Science 287:1960-1964 (2000) • Typically these “disease genes” are linked to another 5 to 10 gene products in physiological circuits which are also suitable for pharmaceutical intervention. • If these numbers are multiplied with the number of diseases that pose a major medical problem in the industrial world, then there are ~5000 to 10000 potential drug targets. Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 37 © Ondřej Slabý, 2009 Drug discovery process – vývoj nového léčiva • Current therapy is based upon less than 500 molecular targets 45% of which are G-protein coupled receptors 28% are enzymes 11% are hormones and factors 5% ion channels 2% nuclear receptors • Therefore, many more drug targets exist! How to identify them? • Besides classical methods of cellular and molecular biology, new techniques of target identification are becoming increasingly important. These include: GENOMIKA, PROTEOMIKA, BIOINFORMATIKA Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 38 © Ondřej Slabý, 2009 Drug discovery process – vývoj nového léčiva Involves demonstrating the relevance of the target protein in a disease process/pathogenicity and ideally requires both gain and loss of function studies. This is accomplished primarily with knock-out or knock-in animal models, small molecule inhibitors/agonists/antagonists, antisense nucleic acid constructs, ribozymes, and neutralizing antibodies. Since strong interactions between a protein and its ligand are characterized by a high degree of complementarity, knowledge of the protein three dimensional structure will enable the prediction of “druggability” of the protein. Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 39 © Ondřej Slabý, 2009 Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 40 © Ondřej Slabý, 2009 Drug discovery process – vývoj nového léčiva Compounds are identified which interact with the target protein and modulate its activity. • Compounds are mainly identified using random (screening) or rational (design) approaches. High throughput screening (HTS) Used to test large numbers of compounds for their ability to affect the activity of target proteins. • Natural product and synthetic compound libraries with millions of compounds are screened using a test assay. (nové chemické/ molekulární látky, NEW CHEMICAL/MOLECULAR ENTITY, NCE/NME) Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 41 © Ondřej Slabý, 2009 Drug discovery process – vývoj nového léčiva Vysokovýkonný screening – High throughput screening (HTS) Drug discovery process – vývoj nového léčiva Racionální design léčiv Three dimensional structures of compounds from virtual or physically existing libraries are docked into binding sites of target proteins with known or predicted structure. • Scoring functions evaluate the steric and electrostatic complementarity between compounds and the target protein. • The highest ranked compounds are then suggested for biological testing. Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 42 © Ondřej Slabý, 2009 Once hits (compounds that elicit a positive response in an assay) have been identified via the screening approach, these are validated by re-testing them and checking the purity and structure of the compounds. Only if the hits fulfill certain criteria are they regarded as leads. The criteria can originate from: 1) Pharmacodynamic properties - efficacy, potency, selectivity 2) Physiochemical properties - water solubility, chemical stability, Lipinski’s “rule-of-five”. 3) Pharmacokinetic properties - metabolic stability and toxological aspects. 4) Chemical optimization potential - ease of chemical synthesis and derivatization. 5) Patentability Drug discovery process – vývoj nového léčiva Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 43 © Ondřej Slabý, 2009 Drug discovery process – vývoj nového léčiva Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 44 © Ondřej Slabý, 2009 Molecules are chemically modified and subsequently characterized in order to obtain compounds with suitable properties to become a drug. Leads are characterized with respect to pharmacodynamic properties such as efficacy and potency in vitro and in vivo, physiochemical properties, pharmacokinetic properties, and toxicological aspects. Potency refers to the amount of drug required for its specific effect to occur; it is measured simply as the inverse of the EC50 for that drug. Efficacy measures the maximum strength of the effect itself, at saturating drug concentrations. Drug discovery process – vývoj nového léčiva Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 45 © Ondřej Slabý, 2009 Preclinical studies involve in vitro studies and trials on animal populations. Wide ranging dosages of the compounds are introduced to the cell line or animal in order to obtain preliminary efficacy and pharmacokinetic information. Úvod do klinických studií - příště Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 46 © Ondřej Slabý, 2009 Molekulární farmakologie II – principy biologické léčby – monoklonální protilátky – příprava monoklonálních protilátek a rekombinantních proteinů, nízkomolekulární inhibitory – racionální design léčiv, siRNA, mikroRNA – tlumení genové exprese na post-transkripční úrovni, transport léčiv (lipozomy, imunoglobuliny, nanočástice a supramolekulární systémy) Náplň příští přednášky Take home Základní pojmy ve farmakologii Farmakokinetika Farmakodynamika - nespecifické, fyzikálně chemické působení léčiv Farmakodynamika - specifické působení léčiv Farmakodynamika - receptory Receptory spojené s G proteiny Receptory spojené s iontovými kanály Receptory s enzymovou aktivitou Jaderné receptory Farmakodynamika – iontové kanály, enzymy, a další Vývoj nových léčiv – přehled Vývoj nových léčiv – identifikace nových terapeutických cílů Vývoj nových léčiv – identifikace nových chemických/molekulárních sloučenin, jejich optimalizace a preklinické zkoušení 1) Strana 47 © Ondřej Slabý, 2009 Úvod do molekulární medicíny 7/12 Strana 37 © Ondřej Slabý, 2009 Dotazy? Úvod do molekulární medicíny 7/12