MikroRNA: biomarkery a potenciální terapeutické cíle v onkologii Ondřej Slabý Masarykův onkologický ústav Klinika komplexní onkologické péče, Centrum pro aplikovaný výzkum v onkologii logo_MOU http://www.economist.com/images/20070616/2407LD1.jpg Screen shot 2010-02-10 at 9.15.07 AM.png Proč se zabývat výzkumem mikroRNA? Nature Biotechnology 21, 1441 - 1446 (2003) 10.10.2010 PubMed - „MicroRNA AND Cancer“ – 3157 odkazů „MicroRNA“ – 8921 odkazů rnai timeline nature Proč se zabývat výzkumem mikroRNA? Screen shot 2010-02-10 at 11.09.39 AM.png Screen shot 2010-02-10 at 11.10.37 AM.png Screen shot 2010-02-10 at 11.24.32 AM.png Proč se zabývat výzkumem mikroRNA? mello_banquet2_photo Craig Mello na slavnostním banketu po udílení Nobelových cen za rok 2006. Biogeneze a funkce mikroRNA 1.Transkripce miRNA genu 2. 2.pri-miRNA jsou zpracovány pomocí RNáz Drosha a Pasha 3. 3.pre-miRNA exportovány pomocí Exportinu 5 do cytoplazmy 4. 4.Zpracovaní pomocí RNázy Dicer 5. 5. Aktivní vlákno je inkorporováno do komplexu RISC 1. 6.Represe translace nebo degradace mRNA v závislosti na míře komplementarity Biogeneze a funkce mikroRNA microRNA: licensed to kill messenger He and Hannon, Nature Reviews Genetics, 2004 Základní fakta o mikroRNA miRNA poprvé popsal Ambros a kol. (1993) u C. elegans (lin-4) Přibližně 3% predikovaných lidských genů jsou geny pro miRNA miRNA mají potenciál regulovat asi 1/3 kódujících genů Některé miRNA jsou kódovány více než jedním genem Geny kódující miRNA jsou často klastrovány (klastr miR-17) Geny miRNA jsou lokalizovány v mezigenových oblastech, v intronových oblastech nebo antisense řetězcích znamých genů Jaký je rozdíl mezi miRNA a siRNA? •Funkce obou je regulace exprese •siRNA je původem dsRNA •siRNA souvisí s cizorodou RNA (obvykle virovou) a je 100% komplementární •miRNA je původně endogenní ssRNA, která formuje vlásenkové dsRNA struktury •miRNA reguluje post-transkripční genovou expresi He and Hannon, Nature Reviews Genetics, 2004 Význam mikroRNA v nádorové biologii Přibližně 50% miRNA genů se nachází na fragilních částech chromosomů, jejichž ztráta nebo amplifikace je často detekována u nádorových onemocnění. Calin et al., PNAS, 2004 Např. miR-15a a miR-16a jsou lokalizované v oblasti 13q14, často deletované u CLL Význam mikroRNA v nádorové biologii Rozdílné expresní profily mezi nádorovou a nenádorovou tkání Volinia et al., PNAS, 2006 Shluková analýza 540 vzorků šesti druhů solidních nádorů a příslušných nenádorových tkání. > Žlutá znamená zvýšenou expresi oproti kontrolnímu (nenádorovému) vzorku Význam mikroRNA v nádorové biologii obr1 Slabý et al, Cas Lek Ces.,2008 Význam mikroRNA v nádorové biologii Slabý et al., Časopis lékařů českých, 2008 Význam mikroRNA v nádorové biologii Rozšíření Vogelsteinova modelu kancerogeneze CRC Screen shot 2010-02-10 at 11.18.50 AM.png Slaby, Svoboda, et al, Molecular Cancer, 2009 nature05939-f1_2 Význam mikroRNA v nádorové biologii Malý pomocníci ve službách strážce genomu - rodina mikroRNA-34 a p53 Pomocí exprese miR-34 (a-c) lze rozlišit wt a p53 deficientní buněčné linie Zvýšená exprese miR-34 (a-c) je spojena se zástavou buněčného cyklu miR-34-a až c jsou pod přímou transkripční kontrolou p53 Le H, Nature, 2007 Význam mikroRNA v nádorové biologii - FFPE MikroRNA nepodléhají degradačním procesům při fixaci formalinem a archivaci v parafinových bločcích tak významně jako mRNA è ZPŘÍSTUPNĚNÍ BOHATÝCH ARCHIVŮ NA PATOLOGIÍCH K RETROSPEKTIVNÍCH STUDIÍM !!! > > > versus mikroRNA z FFPE mRNA z FFPE Yaguang Xi, RNA, 2007, 13:1–7 > Význam mikroRNA v nádorové biologii – cirkulující mikroRNA!!! Gilad et al., 2008 Význam mikroRNA v nádorové biologii – mikroRNA SNP - nový směr molekulární epidemilogie nádorových onemocnění!!! Slaby et al., 2010 1.SNP v biogenezi miRNA 2.SNP v pri-,pre- a miRNA sekvenci 3.SNP ve vazebných místech miRNA G/A ITGB4 (miR-34a) Brendle et al, Carcinogenesis 2009 mikroRNA: potenciální využití v terapii nádorových onemocnění figure3.tif Slaby et al, 2010 Screen shot 2010-02-10 at 11.26.25 AM.png MikroRNA: markery časného záchytu kolorektálního karcinomu Screen shot 2010-02-10 at 9.48.16 AM.png Screen shot 2010-02-10 at 9.49.22 AM.png Ng et al, GUT, 2009 mikroRNA vykazují vysokou míru stability v krevním séru a jsou proto vhodnými kandidáty pro diagnostické markery Screen shot 2010-02-10 at 10.42.54 AM.png Screen shot 2010-02-10 at 10.43.19 AM.png 83% senzitivita, 85% specifita Huang et al, IJC, 2010 MikroRNA: markery časného záchytu kolorektálního karcinomu Screen shot 2010-02-10 at 9.42.11 AM.png Mitchell, PNAS, 2008 Screen shot 2010-02-10 at 9.42.20 AM.png miR-141 jako diagnostický marker karcinomu prostaty Vysoká míra korelace s PSA! Michael et al., Molecular Cancer Research, 2003 Cummins et al., PNAS, 2006 Stanovení profilů miRNA metodou miRAGE Srovnaní profilů miRNA metodou Real-Time PCR Bandres et al., Molecular Cancer, 2006 Srovnání expresních profilů mikroRNA v CRC a nenádorové střevní tkáni miR-21: diagnostický marker kolorektálního karcinomu Screen shot 2010-02-10 at 9.59.26 AM.png Screen shot 2010-02-10 at 10.00.11 AM.png Slaby et al, Oncology, Published online: January 15, 2008 J Schetter et al, JAMA, January 30, 2008 miR-21: prognostický a prediktivní marker kolorektálního karcinomu Schetter et al, JAMA, 2008 Screen shot 2010-02-10 at 9.58.08 AM.png Schetter et al, JAMA, 2008 Long-rank p=0,0015 n=22 n=20 Slaby et al.. 2010 Effect of miR-21 levels on overall survival of CRC patients Screen shot 2010-02-10 at 10.23.51 AM.png Schetter et al, JAMA, 2008 miR-21: prognostický a prediktivní marker kolorektálního karcinomu Sensitizace DLD1 kolorektálního karcinomu k 5-FU transfekcí anti-miR-21 ↓33% ↓30% ↓57% Applied Biosystems microRNA Real-Time PCR cards version 2.0 (667 microRNAs) 47 microRNAs according to paired LIMMA (p<0.001) hsa-miR-935-4395289 hsa-miR-378-4395354 hsa-miR-195-4373105 hsa-miR-137-4373301 hsa-miR-378*-4373024 hsa-miR-422a-4395408 hsa-miR-190-4373110 hsa-miR-144*-4395259 hsa-miR-451-4373360 hsa-miR-630-4380970 hsa-miR-129-3p-4373297 hsa-miR-376c-4395233 hsa-miR-375-4373027 hsa-miR-26b-4395167 hsa-miR-192*-4395383 hsa-miR-139-5p-4395400 hsa-miR-801-4395183 hsa-miR-101-4395364 hsa-miR-519a-4395526 hsa-miR-618-4380996 hsa-miR-30e-4395334 hsa-miR-30e*-4373057 hsa-miR-145-4395389 hsa-miR-15a-4373123 hsa-miR-136*-4395211 hsa-miR-30a*-4373062 hsa-miR-135b-4395372 hsa-miR-299-3p-4373189 hsa-miR-1-4395333 … by use of R, Bioconductor Comparison of miRNA expression profiles in CRC and matched non-tumoral tissue In the last months we started with the global expression profiling by use of the Real-Time PCR array technology of Applied Biosystems, which allows us to quantify 667 microRNAs expression in paralell. Here you can see our preliminary data from comparison of miRNA profiles in CRC tissue and non-tumoral colon tissue of 8 patients. For Biostatistical analysis we have used the statistical software R and Bioconductor package. From this heat-map is evident that specific miRNA profile of CRC exist and can be identified. Some of the miRNAs identifed were observed in another studies previously. According to LOOCV method Sensitivity 79% Specifity 81% Balanced accuracy 80% Detection of lymph nodes metastatic involvement from primary CRC tumor N+M0…blue (20 patients) N0M0…res (25 patients) Slaby et al.. 2010 Another issue we are interested in Camps et al, Clin Cancer Res, 2008 Foekens et al, PNAS, 2008 Iorio, Cancer Res 2006 miR-210: prognostický marker u mamárního karcinomu miR-210 transkripčně kontrolován HIF1alfa zapojen do procesů indukovaných hypoxií Screen shot 2010-02-10 at 11.57.52 AM.png N=111 N=106 Screen shot 2010-02-10 at 12.02.10 PM.png miR-26a: prognostický a prediktivní marker hepatocelulárního karcinomu Junfang et al, NEJM, 2009 Predikce odpovědi na léčbu interferonem miR-10b, miR-21, miR-223, miR-338, let-7a, miR-30a-5p, miR-126 Xiaoh et al, Gut, 2010 mikroRNA: prognostická sada 7 mikroRNA u karcinomu žaludku figure1.jpg Nováková, Slabý, BBRC 2009 MikroRNA v patogenezi glioblastomu figure2.jpg Nováková, Slabý, BBRC 2009 MikroRNA v patogenezi glioblastomu MikroRNA ve výzkumu glioblastomu – mikroRNA-21 Transientní transfekce anti-miR-21 vede k indukci apoptózy a snížení viability buněk v buněčné linii odvozené od GBM Tento efekt detekovatelný také in-vivo Corsten et al, 2007 Chan et al, 2006 O6-metylguanin-DNA metyltransferáza (MGMT) v predikci odpovědi na léčbu temozolomidem (TMZ) gen MGMT exprese Promotorová oblast exprimován GBM s metylovaným promotorem MGMT •Není reparační protein DNA - MGMT •Nejsou opravována poškození DNA indukovaná účinkem temozolomidu •Lepší odpověď na léčbu •Lepší přežití pacientů s glioblastomem Metylovaný bez « turned off » Nemetylovaný Prediktivní význam vybraných mikroRNA u pacientů s multiformním glioblastomem – odpověď na nové alkylační agens temozolomid Referenční metoda, stav metylace promotoru genu pro reparační protein MGMT stanovený metodou metylačně specifické Real-Time PCR (MSP) long-rank p=0,1455 n=12 n=11 Nemetylovaný promotor Vyšší hladiny MGMT Vyšší DNA reparační kapacita - prognostický faktor Metylovaný promotor Nižší hladiny MGMT + prognostický faktor Prediktivní význam vybraných mikroRNA u pacientů s multiformním glioblastomem – mikroRNA-181b Vliv hladin miR-181b na OS pracientů s glioblastomem (long-rank p=0,0409) Vztah hladin miRNA-181b a radiologické odpovědi (MRI 1měsíc po terapii) na konkomitantní RT/TMZ (p=0,036, Mann-Whitney test) Srovnání hladin miR-181b v AVM a GBM (p=0,0181) Slaby et al., Neoplasma, 2009. Molekulární klasifikace karcinomu prsu Triple Negative (ER-, PR-, HER2-) Zvýšená proliferace (P < 0.0001) Výsoký grade (P < 0.0001) Nízká diferenciace (P < 0.003) Mutace v TP53 (P< 0.001) Basal-like karcinom prsu C:\data\basallike\graf1uzliny.gif C:\data\basallike\graf2os.gif Význam rodiny mikroRNA-34a-c u „basal-like“ mamárního karcinomu miR-34a je signifikantně zvýšená u pacientek s „basal-like“ karcinomy metastazujícími do uzlin. miR-34b je silný negativní prognostický faktor. Screen shot 2010-02-10 at 10.31.29 AM.png Screen shot 2010-02-10 at 10.35.25 AM.png Santaris Pharma begins human clinical testing of world's first microRNA SPC3649 (LNA-antimiR-122) being developed as a potential new therapy for Hepatitis C virus (HCV) infection May 28, 2008 – Santaris Pharma, the Danish biopharmaceutical company, announced today that it has commenced a Phase I human volunteer trial of the world’s first microRNA medicine to be tested in man - SPC3649 (LNA-antimiRTM-122). The study is being conducted by PhaseOneTrials A/S, Copenhagen, and will include a maximum of 48 healthy male volunteers. The Company also announced that the first cohort of healthy volunteers in the study have completed treatment satisfactorily. SPC3649 is being developed by Santaris Pharma as a potential new approach to the treatment for Hepatitis C infection. Phase II studies in hepatitis C patients will follow. SPC3649 specifically targets microRNA-122, a small, liver-expressed, regulatory ribonucleic acid (RNA) that has recently been shown to facilitate human Hepatitis C virus replication in liver cells.
 Děkuji Vám za pozornost C:\obr1.gif Poděkování Masarykův onkologický ústav prof. MUDr. Rostislav Vyzula, Ph.D. MUDr. Marek Svoboda, Ph.D. MUDr. Pavel Fabian, Ph.D. MUDr. Rudolf Nenutil, Ph.D. MUDr. Milana Šachlová, Ph.D. MUDr. Radek Lakomý MUDr. Eva Lžičařová Mgr. Roman Hrstka, Ph.D. FN Brno Neurochirurgická klinika MUDr. Pavel Fadrus, Ph.D. prof. MUDr. Martin Smrčka, Ph.D. Ústav patologie MUDr. Leoš Křen, Ph.D. Univerzitní centrum buněčné imunoterapie prof. MUDr. Jaroslav Michálek, Ph.D. deregulace hladin miRNA klinická pozorování ? logo_MOU ucic_logo_text_en C:\data\konf\abi2008b\fnbrno.tif