Úloha 2: Stanovení změny exprese genů pro pathogenesis related (PR) proteiny u rostlin tabáku Pokročilé praktikum z Biochemie (122009) 1 Stanovení změny exprese genů pro pathogenesis related (PR) proteiny u rostlin tabáku TEORETICKÝ ÚVOD Na počátku byly PR (pathogenesis related) proteiny identifikovány jako proteiny, které se nevyskytují ve zdravých rostlinách a po infekci patogenem dochází k jejich masivní akumulaci. Do dnešní doby je známa celá řada PR proteinů, které byly rozděleny do 14 tříd, jak je uvedeno v tabulce níže. Každá třída může být dále dělena na kyselé a bazické homology. Syntéza kyselých forem PR proteinů je obvykle spojena s infekcí patogenem a u rostlin jejich syntéza vyvolává tzv. systémově navozenou rezistenci (SAR – systemic acquired resistance). Na druhé straně syntéza bazických forem PR proteinů je spojena s poškozením nebo napadením rostliny herbivorním hmyzem. Jejich syntéza je poté spojena s tzv. rezistencí proti herbivornímu hmyzu (IRH - induced resistance against herbivores). Třída Název Funkce PR-1 PR-1 Tabák neznámá PR-2 PR-2 Tabák -1,3-glukanasa PR-3 P, Q Tabák chitinasa PR-4 `R' Tabák chitinasa PR-5 S Tabák podobný thaumatinu PR-6 Inhibitor I Rajče proteinasový-inhibitor PR-7 “P“ Rajče endoproteinasa PR-8 Chitinasa Okurka chitinasa PR-9 `lignin-forming peroxidase' Tabák peroxidasa PR-10 `PR1` Pšenice podobný ribonuclease PR-11 třída V Tabák chitinasa PR-12 Radish Rs-AFP3 defensin PR-13 Arabidopsis THI2.1 thionin PR-14 LTP4 Pšenice lipid-transfer protein Literatura 1. Buchanan B. B., Gruissem W., Jones R. L.: Biochemistry & molecular biology 2. Edreva A. (2005): Pathogenesis-related proteins: Research progress in the last 15 years. Gen. Appl. Plant Physiology 31(1-2), 105-124. 3. Mikeš V., Milat M-L., Ponchet M., Ricci P., Blein J-P. (1997): The fungal elicitor cryptogein is a sterol carrier protein. FEBS Letters 416, 190-192. Úloha 2: Stanovení změny exprese genů pro pathogenesis related (PR) proteiny u rostlin tabáku Pokročilé praktikum z Biochemie (122009) 2 POSTUP PRÁCE Izolace celkové RNA z listu tabáku Jednotlivé skupiny si rozdělí izolaci celkové RNA z listů po aplikaci cryptogeinu a kontrolních listů po aplikaci vody sesbíraných v časových intervalech 0h, 8h a 24h po aplikaci. 1. Odeberte 100 mg tkáně a vložte ji do 2.0 ml zkumavky společně s drtícím olůvkem. 2. Vložte zkumavky do drtící vložky, zašroubujte vložku víčkem a vhoďte ji do kapalného dusíku. Po vymražení zasuňte vložku do pouzdra a asi minutu třepejte. 3. Poté vyjměte zkumavku z vložky, otevřete ji, pomocí pinzety vejměte olůvko a přidejte 1.0 ml TRI reagentu. Inkubujte zkumavku přibližně 5 minut při pokojové teplotě. 4. Přidejte 0.2 ml chloroformu, vortexujte 15 s a nechte stát 5-10 minut při pokojové teplotě 5. Horní vodnou fázi přeneste do čisté zkumavky a přidejte 1/10 objemu isopropanolu 6. Opatrně promíchejte a nechte stát při pokojové teplotě po dobu 5-10 minut 7. Centrifugujte při 12 000xg po dobu 10 minut při 4oC. 8. Odsajte supernatant a přidejte k němu zbývající množství isopropanolu, aby celkový přidaný objem isopropanolum byl 500 ul. 9. Opatrně promíchejte a nechte stát při pokojové teplotě po dobu 5-10 minut 10. Centrifugujte při 12 000xg po dobu 10 minut při 4o C. 11. Odstraňte supernatant a vysráženou RNA promyjte 1ml 75% ethanolu 12. Centrifugujte při 7500xg po dobu 5 minut při 4o C 13. Odstraňte supernatant a RNA nechte asi 10-15 minut vyschnout 14. Rozpusťte RNA ve formamidu předehřátém na 55o C. Stanovení koncentrace a čistoty vyizolované RNA pomocí Nano-fotometru Do dvou 1.5 ml zkumavek napipetujte 9 ul DEPC vody. Do jedné přidejte 1.0 ul formamidu (BLANK) a do druhé 1.0 ul vyizolované RNA. Promíchejte zkumavky na vortexu a krátce stočte. 1. Na fotometru nastavte měření koncentrace RNA a ředící koeficient 10x. 2. Na čočku měřící kyvety nepipetujte 3 ul DEPC vody s formamidem a zakryjte vrškem s faktorem 10 3. Zmáčkněte tlačítko pro měření Blanku (BLANK). 4. Čočku a vršek otřete tampónem a poté na čočku napipetujte 3 ul ředěného vzorku RNA. 5. Zakryjte čočku vrškem s faktorem 10 a zmáčkněte tlačítko pro měření vzorku (SAMPLE) 6. Vytisknete koncentraci a hodnoty čistoty A260/280, A230/260 a naměřené spektrum. Úloha 2: Stanovení změny exprese genů pro pathogenesis related (PR) proteiny u rostlin tabáku Pokročilé praktikum z Biochemie (122009) 3 Elektroforéza vyizolované RNA Příprava gelu: 1. Zahřejte 1.75 ml formaldehydu a 3.0 ml 10x MOPS pufru na 55oC. 2. Rozpusťte 0.4 g agarosy v 25 ml vody. 3. Zchlaďte agarosu na 55o C a přidejte formaldehyd, 10x MOPS pufr a 15 ul EtBr. 4. Nalijte gel Připravte vzorek podle následující tabulky: Objem (ul) RNA 3 formaldehyd 2.25 formamid 7.5 10x MOPS 0.75 Voda 1 Celkový 15 Inkubujte vzorek 15 minut při 55o C. Po denaturaci přidejte 1.5 ul 10x nanášecí barvičky, promíchejte a naneste vzorek na gel. Jako elektroforetický pufr použijte 1x MOPS pufr. Reverzní transkripce izolované RNA Nařeďte vyizolovanou RNA na koncentraci 0.2 ug/ul a umístěte ji na led. Připravte reakční směs: 5 x RT ImPromII buffer 2.0 ul 25 mM MgCl2 2.2 ul dNTPs 1.0 ul Random Hexamers 0.5 ul Voda 2.6 ul Reverse transcriptase 0.5 ul RNasin 0.1 ul Přidejte do reakční směsi 1.0 ul naředěné RNA o koncentraci 0.2 ug/ul. Vložte zkumavku do termocycleru a nastavte následující program: 25o C 10 min 42o C 45 min 72o C 15 min 4o C hold Úloha 2: Stanovení změny exprese genů pro pathogenesis related (PR) proteiny u rostlin tabáku Pokročilé praktikum z Biochemie (122009) 4 Amplifikace cDNA genu pro PR1a protein pomocí RealTime PCR Připravíme si reakční směs vztaženou na 1 vzorek dle následující tabulky, kdy k amplifikaci využijeme primery pro geny PR1a nebo PR5a nebo PAL nebo EF1a: 2 x KAPA SYBR Mix 7.5 ul F primer (10 uM) 0.5 ul R primer (10 uM) 0.5 ul Voda 5.0 ul Reakční směs promícháme, krátce stočíme a přidáme 1.5 ul cDNA vzniklé po reverzní transkripci nebo kvantifikačních standardů. Vložte zkumavku do termocycleru a nastavte následující program: 95o C 2 min 95o C 20 s 60o C 40 s (odečet fluorescence) 40x VYHODNOCENÍ - Uveďte koncentraci a na základě naměřených dat zhodnoťte čistotu izolované RNA - Na základě výsledku RealTime PCR vypočítejte metodami absolutní nebo relativní kvantifikace za použití delta Ct metody, zdali dochází po přidání kryptogeinu ve sledovaných časových intervalech (8 a 24h) ke zvýšení exprese vybraných PR proteinů a o jak velké zvýšení se jedná. - Dále na základě vypočtených výsledků porovnejte metodiky relativní a absolutní kvantifikace.